新疆野生樱桃李(Prunus cerasifera)叶黄酮类成分研究

刘伟，李紫薇，王航，杨凤玲，李明玺，刘晓，万春鹏

（1.伊犁师范学院，自治区教育厅普通高校重点实验室，新疆伊宁 835000）（2.江西农业大学农学院，江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心，江西南昌 330045）

野生樱桃李(Prunus cerasifera)，也称野酸梅，为蔷薇科李属落叶灌木或小乔木，是一种极为珍贵和罕见的且濒危灭绝的原始野生林果，主要分布于高加索、小亚细亚及巴尔干半岛，在我国仅分布于新疆天山伊犁河谷-大西沟和小西沟[1]。目前，已有新疆野生樱桃李的扦插繁殖报道[2]，在新疆地区有多个人工栽培品种[3,4]。文献报道新疆野生樱桃李果实营养成分种类齐全，还原性糖、总糖和氨基酸等初级代谢产物含量丰富[5]，多酚[6]、花色苷[7]和总黄酮[8]等次级代谢产物及矿物质[9]含量较高。野生樱桃李多酚、总黄酮和花色苷具有很好的抗氧化活性[10,11]，前期研究发现野生樱桃李枝、叶不同部位含有丰富的多酚和黄酮类化合物，他们具有较好的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性[12,13]；乙酸乙酯萃取部位多酚和总黄酮含量最高，且抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性最强，乙酸乙酯萃取部位为活性部位。综上所述，目前对野生樱桃李的化学成分研究仅限于总黄酮、多酚等的提取方面，前期我们也发现野生樱桃李叶酸水解产物主要为山柰酚和槲皮素，说明山柰酚和槲皮素衍生物为野生樱桃李的主要成分[14]，但对其多酚及黄酮类成分的系统分离及结构鉴定方面的研究还未见报道。

本文采用各种柱层析技术对野生樱桃李叶甲醇提取物乙酸乙酯萃取部位进行系统分离纯化，采用核磁共振波谱技术鉴定了分离的化合物结构，从野生樱桃李叶乙酸乙酯萃取部位中共分离并鉴定了 11个黄酮类化合物，所有黄酮类化合物均为首次从新疆野生樱桃李叶中分离鉴定，槲皮素和山柰酚糖苷类成分是野生樱桃李叶中主要的黄酮类成分。本研究为野生樱桃李的综合开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生樱桃李叶于2015年10月采自新疆伊犁霍城县大西沟，经伊犁师范学院资源与生态研究所赵玉教授鉴定为蔷薇科野生樱桃李(Prunus cerasifera)；环己烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、氯仿等有机溶剂均购自国药集团化学试剂有限公司；色谱甲醇为Sigma公司产品；聚苯乙烯型MCI GEL CHP20P (75～150 µm)填料为日本三菱化学公司产品；Sephadex LH-20凝胶为GE公司产品；ODS反向硅胶柱为YMC公司产品；所有色谱填料均购自北京慧德易科技有限责任公司；制备HPLC色谱柱为菲罗门Luna C18（250 mm×10 mm，5 µm）；氘代甲醇试剂购自青岛腾龙微波科技有限公司。

1.2 主要仪器

布鲁克400 MHz型核磁共振仪(TMS内标)，旋转蒸发仪(瑞士步琪)，冷冻干燥机(东京理化)，日立制备高效液相色谱仪系统包括L2130泵，L-2200自动进样器，L-2455二极管阵列检测器等。

1.3 提取分离方法

2 kg野生樱桃李叶，实验室摊放阴干后，60 ℃鼓风干燥箱中干燥2 h，粉碎机粉碎后，过60目筛。野生樱桃李叶粉末每次用10 L甲醇室温浸泡提取3次，合并3次提取液后过滤，减压浓缩，得甲醇提取物210 g。取200 g提取物浸膏溶解于4 L蒸馏水中，依次用等体积的环己烷、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取三次，分别合并萃取液后减压浓缩。根据前期抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性测试结果[12,13]，直接选取乙酸乙酯萃取部位进行后续黄酮类成分分离。

乙酸乙酯萃取物溶解于适量超纯水中，离心，取上清液上于MCI柱、依次采用超纯水、30%甲醇、50%甲醇和90%甲醇梯度洗脱，收集醇洗脱部位得到4个流分(EPA-EPD)。EPB流分采用硅胶柱分离，氯仿和甲醇混合溶剂梯度洗脱（100：1，50：1，30：1，20：1，10：1，8：1，6：1，4：1，2：1，V/V），经薄层层析及 HPLC分析合并为 7个流分(EPB1～EPB7)。EPB4流分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离（甲醇洗脱）后相应流分再经半制备液相分离纯化得到化合物1，2，5，6，8，9和10。EPB5流分经C18中压色谱(MPLC)分离，甲醇：水梯度洗脱后再经半制备液相分离纯化得到化合物3，4，7和11。HPLC二极管阵列检测器采集化合物的紫外吸收光谱，化合物旋转蒸发去除溶剂后，冷冻干燥得到固体粉末，化合物溶解于氘代甲醇用于后续NMR测试。

2 结果与讨论

槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(1)黄色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=256, 356 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.51 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-2'),7.47 (1H, dd,J= 7.6, 1.6 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5'), 6.37 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-8), 6.18 (1H, d,J=1.4 Hz, H-6), 5.45 (1H, s, H-1"), 4.32 (1H, d,J= 2.4 Hz,H-5"), 3.88 (2H, m), 3.49 (2H, m)。化合物1的13C-NMR数据（见表1），根据1H和13C-NMR数据确定化合物1为槲皮素糖苷，查阅文献，化合物1的NMR数据与文献[15]报道的槲皮素呋喃阿拉伯糖苷一致，确定化合物1为槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

槲皮素-3-O-β-D-木糖苷(2)黄色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=255, 358 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.59 (1H, brs, H-2'), 7.57 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6'), 6.84 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5'), 6.37 (1H,brs, H-8), 6.18 (1H, brs, H-6), 5.16 (1H, d,J= 7.2 Hz,H-1"), 3.06-3.79 (5H, m, H-2"-5")。化合物2的1H-NMR数据与化合物1类似，也为槲皮素糖苷，化合物2的13C-NMR数据（见表1），查阅文献，化合物2的NMR数据与文献[16]报道的槲皮素-3-O-β-D-木糖苷一致，确定化合物2为槲皮素-3-O-β-D-木糖苷。

槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(3)黄色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=257, 356 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.82 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2'),7.58 (1H, dd,J= 1.8, 8.4 Hz, H-6'), 6.85 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5'), 6.39 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,J=1.6 Hz, H-6), 5.15 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1"), 3.82 (1H,m), 3.78 (1H, d,J= 7.8 Hz), 3.64 (1H, m), 3.54 (2H, m),3.45 (1H, m)。化合物3的1H-NMR数据与化合物1，2类似，也为槲皮素糖苷，化合物3的13C-NMR数据（见表1），查阅文献，化合物3的NMR数据与文献[15]报道的一致，确定化合物3为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷。

槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)黄色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=256, 356 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.31 (1H, brs, H-2'), 7.29 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6'), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5'), 6.36 (1H,d,J= 1.0 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,J= 1.0 Hz, H-6), 5.33(1H, s, H-1"), 4.20 (1H, s), 3.72 (1H, m), 3.58 (1H, brs),3.39 (1H, m), 0.92 (3H, d,J= 6.0 Hz, CH3)。化合物4的1H-NMR数据与化合物1，2类似，也为槲皮素糖苷，δ 0.92 (3H, d,J= 6.0 Hz, CH3) 提示为鼠李糖。13C-NMR数据进一步（见表1）证实其为鼠李糖[17]，确定化合物4为槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(5)黄色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.93 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2', 6'),6.90 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3', 5'), 6.37 (1H, s, H-8), 6.18(1H, s, H-6), 5.46 (1H, s, H-1"), 4.30 (1H, d,J= 2.4 Hz,H-5"), 3.89 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.47 (2H, m)。化合物5的13C-NMR数据（见表1），根据1H和13C-NMR数据确定化合物5为山柰酚糖苷，化合物5的糖基与化合物1类似，化合物5的NMR数据与文献[17]报道一致，确定化合物5为山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

山柰酚-3-O-β-D-木糖苷(6)黄色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 8.01 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2', 6'),6.86 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3', 5'), 6.38 (1H, s, H-8), 6.19(1H, s, H-6), 5.17 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1"), 3.06-3.76(5H, m, H-2"-5")。化合物6的1H-NMR数据与化合物5类似，也为山柰酚糖苷，化合物6的13C-NMR数据（见表1），根据13C-NMR数据确定化合物6的糖基与化合物2类似，也为木糖苷；化合物6的NMR数据与参考文献[18]中山柰酚-3-O-β-D-木糖的NMR数据一致，确定化合物6为山柰酚-3-O-β-D-木糖苷。

山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)黄色粉末; UV-vis(MeOH)λmax=265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 8.04 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2', 6'),6.87 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3', 5'), 6.39 (1H, s, H-8), 6.19(1H, s, H-6), 5.24 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1"), 3.68 (1H, dd,J= 1.8, 11.8 Hz, H-6"), 3.51 (1H, dd,J= 5.4, 11.8 Hz,H-6"), 3.31-3.42 (3H, m, H-2", 3", 4"), 3.19 (1H, m,H-5")。化合物7的1H-NMR数据与化合物5类似，也为山柰酚糖苷，化合物7的1H-NMR数据与参考文献[18]中山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的1H-NMR数据一致，确定化合物7为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8)黄色粉末；UV-vis(MeOH)λmax= 265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz) 7.75 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2', 6'),6.91 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-3', 5'), 6.36 (1H, s, H-8), 6.18(1H, s, H-6), 5.36 (1H, s, H-1"), 4.20 (1H, brs), 3.70 (1H,m), 3.60 (1H, brs), 3.33 (1H, m), 0.90 (3H, brs, CH3)提示为鼠李糖苷；化合物8的13C-NMR数据（见表1），化合物 8的 NMR数据与文献[18]报道的山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷一致，确定化合物 8为山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

反式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(9)白色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=220, 286 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)7.34 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2', 6'),6.77 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 6.22 (1H, d,J= 1.8 Hz,H-8), 6.19 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 5.47 (1H, s, H-1"),5.38 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2), 4.21 (1H, d,J= 2.2 Hz,H-3), 3.77 (1H, dd,J= 3.2, 9.4 Hz), 3.53 (1H, m), 3.43(1H, t,J= 9.4 Hz), 3.29 (1H, m), 1.22 (3H, d,J= 6.0 Hz,CH3) 提示为鼠李糖苷；化合物9的1H-NMR数据与化合物8类似，化合物9多两个质子信号5.38 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2), 4.21 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-3)，化合物9的13C-NMR数据（见表1），提示化合物9为二氢山柰酚糖苷。化合物9的NMR数据与参考文献[19]中二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的NMR数据基本一致，根据H-2和H-3的耦合常数(J= 2.2 Hz)，确定其为反式结构[20]，化合物9为反式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

顺式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(10)白色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=220, 286 nm。1H-NMR (400 MHz, CD3OD, δ, ppm,J/Hz)7.34 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2', 6'), 6.82 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 6.20 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-8), 6.15 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-6), 5.46 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-1"), 5.01 (1H, d,J= 11.7 Hz, H-2), 4.56(1H, d,J= 11.7 Hz, H-3), 3.77 (1H, dd,J= 3.2, 9.4 Hz),3.53 (1H, m), 3.43 (1H, t,J= 9.4 Hz), 3.29 (1H, m), 1.21(3H, d,J= 6.1 Hz, CH3) 提示为鼠李糖苷；化合物10的1H-NMR数据与化合物9非常类似，主要的区别在于H-2和H-3的耦合常数不同，化合物10中H-2和H-3的耦合常数为J= 11.7，确定其为顺式结构[20]。确定化合物10为顺式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

顺式-二氢山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(11)白色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=220, 286 nm。1H-NMR (400 MHz, CD3OD, δ, ppm,J/Hz)7.35 (2H, d,J= 8.1 Hz,H-2', 6'), 6.82 (2H, d,J= 8.1 Hz, H-3', 5'), 6.17 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-8), 6.14 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 5.02 (1H,dd,J= 4.3, 11.7 Hz, H-2), 4.58 (1H, d,J= 3.5, 11.7 Hz,H-3), 4.91 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1"), 3.98 (1H, m), 3.89(1H, dd), 3.52 (1H, m), 3.38 (3H, m)。化合物11的1H-NMR数据与化合物10类似，也为顺式-二氢山柰酚糖苷类化合物，化合物11的1H-NMR数据与参考文献[21]中二氢山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的1H-NMR数据一致，确定化合物 11为顺式-二氢山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

表1 黄酮类化合物1-6和8的13C-NMR数据(100 MHz，CD3OD)Table 1 13C-NMR data of flavonol compounds1-6 and 8 (100 MHz, CD3OD)

3 结论

采用各种柱层析技术从野生樱桃李叶醇提取物乙酸乙酯萃取部分中共分离并鉴定了 11个黄酮类化合物，他们分别为：槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(1)，槲皮素-3-O-β-D-木糖苷(2)，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(3)，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)，山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(5)，山柰酚-3-O-β-D-木糖苷(6)，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8)，反式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(9)，顺式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(10)，顺式-二氢山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(11)。所有黄酮类成分均为首次从新疆野生樱桃李叶中分离鉴定，槲皮素和山柰酚糖苷是其主要的黄酮类成分。本研究为野生樱桃李的综合开发与利用提供理论依据。