气相色谱-质谱指纹图谱结合聚类分析在薄荷香精风味品质稳定性分析中的应用

陆智

（无限极（中国）有限公司，广东广州 510665）

薄荷，唇形科芳香作物，其主要成分包括挥发油、黄酮和酚类等[1,2]，具有抗菌、抗炎和抗氧化等作用[3～5]，常以薄荷香精的形式添加到产品中。薄荷香精具有纯正的薄荷风味，凉感强劲，香气清新透澈，广泛应用于牙膏、饮料、糕点、日用化妆品和烟酒等产品[6～10]。薄荷香精是一种较为复杂的化学体系，分为天然薄荷香精和人工合成薄荷香精。天然香精比较昂贵且不易获得，普遍被人工合成香精代替。

为了对薄荷香精的质量以及其在加香产品中添加量等指标进行准确控制，需要对其成分进行准确定性定量，并需对批次间样品的风味品质稳定性进行分析。目前对香精质量控制主要依靠品香师的经验和简单的理化指标，信息量少，无法达到准确控制目的。薄荷香精中的挥发性成分是薄荷香精的主要成分，故可用作薄荷香精质量控制的靶标物质。常用的香精中挥发性成分的检测方法有气相色谱[11～13]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[14～17]等。马永昆等[18]人利用 GC-MS 方法检测天然苹果香精中乙酸乙酯等11种特征香气成分；綦艳梅[21]等人采用同时蒸馏萃取法结合GC-MS分鉴定出牛肉香精中 64种挥发性香气成分；刘更涛[22]利用GC-MS检测了牡丹香精中22种化学成分。常用的香精中挥发性成分的提取方法有顶空固相微萃取、溶剂萃取、超临界液体萃取等[19,20]；但是这些提取方法比较耗时且样品消耗量大，现普遍探索满足于仪器分析条件的直接进样方式，简便快捷，且能更好地反映香精成分的真实情况。香精风味品质稳定性可利用挥发性成分指纹图谱的共有峰率和相似度进行评价，并可利用主成分分析和聚类分析等方法做进一步评价。

本研究拟采用GC-MS结合内标法分析薄荷香精中主要挥发性成分，通过组分含量的相对标准偏差及相似度等指标评价5个不同批次薄荷香精的一致性，进一步结合聚类分析方法对薄荷香精批次间品质稳定性进行分析，以为薄荷香精的质量控制提供便捷、直观的分析方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

邻二氯苯、癸醇、十二醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪，色谱纯，购自Sigma公司；甲醇、丙酮均为色谱纯，购自上海安谱实验科技股份有限公司。

安捷伦7890B-5977B气相色谱-质谱仪（配有EI源，自动进样装置），美国Agilent公司；漩涡振荡器（VORTEX-5），海门市其林贝尔仪器制造有限公司；分析天平（FA2014），上海良平仪器仪表有限公司等。

1.2 样品及前处理

同一公司的5个不同批次的薄荷香精由某香精公司提供。

称取薄荷香精1 mL于进样小瓶，直接进样，供GC-MS分析。

1.3 色谱和质谱条件

色谱柱：HP-Innowax极性色谱柱：60 m×0.25 mm×0.25 µm；载气为氦气，纯度≥99.999%；流速：0.8 mL/min。进样口温度：250 ℃；进样体积：0.2 µL。

质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：50～550 u。检测方式：全扫描和SIM碎片扫描。

本研究对升温程序进行了优化，对比6个气相色谱升温程序的分析效果，以化合物解析数量为指标确定最优升温程序。

升温程序（1）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；5 ℃/min 至 230 ℃，保持 20 min。分流比：20：1。

升温程序（2）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；3 ℃/min 至 230 ℃，保持 5 min。分流比：50：1。

升温程序（3）：40 ℃，6 min；5 ℃/min 至100 ℃；3 ℃/min 至 230 ℃，保持 10 min。分流比：20：1。

升温程序（4）：40 ℃，6 min；5 ℃/min 至100 ℃；3 ℃/min 至 230 ℃。分流比：10：1。

升温程序（5）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；5 ℃/min 至 230 ℃，保持 20 min。分流比：30：1。

升温程序（6）：40 ℃，6 min；3 ℃/min 至100 ℃；5 ℃/min 至 230 ℃，保持 20 min。分流比：20：1。

1.4 定性和定量分析

将C5-C24的正构烷烃标样进入GC-MS分析，计算检测物质的保留指数（RI）。利用质谱图，比对数据库（NIST/WILEY）中的标准谱图，采用匹配度大于80%的鉴定结果，并与文献中的RI值进行比对，进而确定该物质。

本研究采用内标法进行定量分析，选择对比四个物质：邻二氯苯、癸醇、十二醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪，确定最终内标物质。

1.5 相似度和相对标准偏差

相似度可反映指纹图谱之间的相似程度，可用于样品的甄别[23]。本研究采用夹角余弦法[24]计算5个薄荷香精香气指纹图谱间的相似度。

本研究采用Excel计算5个薄荷香精挥发性物质含量间的相对标准偏差（RSD%）。

1.6 聚类分析

聚类分析可用于衡量不同图谱间的相似性，以及把数据源分类到不同的簇中[25]。本研究采用SPSS软件中的Ward法结合平方Euclidean距离对5个薄荷香精进行聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 升温程序优化

实验结果表明，6个升温程序条件下薄荷香精中的挥发性物质均得到较好的分离，峰形差异不明显。6个升温程序分别分离得到148个、84个、116个、104个、101个和153个出峰。通过解析化合物数量多少的对比，选择 40 ℃，6 min；3 ℃/min 至 100 ℃；5 ℃/min至230 ℃，保持20 min，分流比：20：1作为色谱升温程序，色谱图见图1。

图1 最优升温程序条件下的薄荷香精色谱谱图Fig.1 Chromatogram of peppermint flavor under optimal temperature program

2.2 内标的选择

本实验选择对比四个内标物质：邻二氯苯、癸醇、十二醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪。结果表明，2-甲氧基-3-甲基吡嗪出峰位置为30.96 min左右，与薄荷香精成分出峰位置无重叠，且响应丰度良好，用作内标，其色谱图见图2。

图2 内标2-甲氧基-3-甲基吡嗪色谱谱图Fig.2 Chromatogram of 2- methoxy -3- methylpyrazine used as internal standard

2.3 薄荷香精成分分析结果

采用优化好的色谱升温程序对薄荷香精成分进行分析，并对5个薄荷香精的挥发性成分进行定量分析，分析结果见表1。

表1 5个薄荷香精样品共同挥发性成分及含量Table 1 Volatile compounds in the 5 peppermint flavors

23 25.5891 反式乙位罗勒烯 109.4 106.9 114.3 113.9 125.6 6.282 0.884 24 25.71 3-辛酮 66.5 64.2 82.0 63.8 73.1 11.026 0.728 25 26.562 对伞花烃 4977.8 4967.8 5358.0 5323.9 5336.8 3.876 1.000 26 26.9083 2-甲基丁酸-2-甲基丁酯 50.4 44.0 61.4 55.4 52.5 12.132 0.571 27 27.0941 4-蒈烯 351.5 335.9 344.4 373.7 397.3 6.892 0.986 28 27.3931 正辛醛 44.6 42.0 52.8 56.0 50.9 11.749 0.529 29 27.6284 戊酸-2-甲基丁酯 54.3 51.8 53.6 49.6 53.7 3.627 0.565 30 29.129 3-甲基环己酮 144.2 139.5 179.1 156.5 152.6 9.947 0.915 31 29.8711 正己醇 49.9 52.4 76.7 55.0 60.7 18.140 0.567 32 30.799 己酸烯丙酯 2915.1 2891.1 3868.2 3077.2 3139.3 12.580 1.000 33 31.1596 叶醇 95.2 108.9 119.9 116.1 114.7 8.679 0.826 34 31.4377 3-辛醇 1694.4 1649.2 2146.0 1756.9 1786.1 10.912 0.999 35 31.6829 壬醛 26.7 27.1 40.0 30.7 30.6 17.333 0.345 36 33.3374 2,4-二甲基苯乙烯 114.7 111.0 123.7 117.1 122.3 4.494 0.826 37 33.3693 顺式氧化芳樟醇 90.7 96.5 108.7 119.3 108.1 10.706 0.783 38 33.4562 异戊酸己酯 279.9 277.9 142.2 97.1 115.8 48.957 0.872 39 33.6377 (-)-Α-荜澄茄油烯 141.0 140.5 83.9 176.8 154.8 24.627 0.844 40 34.063 顺式水合桧烯 518.8 490.7 613.7 534.5 551.0 8.484 0.990 41 34.373 薄荷酮 50514.9 49169.4 71048.8 53665.4 58726.3 15.650 1.000 42 34.4595 醋酸辛酯 94.7 85.5 90.3 81.0 82.0 6.647 0.698 43 34.6403 丙位榄香烯 1768.0 1506.6 1591.4 1428.0 1478.8 8.569 0.999 44 34.7468 2-乙基己醇 306.2 262.6 381.4 336.5 307.4 13.730 0.970 45 34.8031 甲位古巴烯 53.9 1974.4 252.9 13.8 21.7 183.532 0.163 46 34.8711 异戊酸叶醇酯 925.1 898.9 1135.9 995.6 1020.8 9.350 0.997 47 34.9447 薄荷呋喃 5230.4 5731.3 6656.6 4908.7 5639.9 11.722 1.000 48 35.2339 杜松-3,5-二烯 105.2 94.1 159.9 153.3 102.6 25.219 0.801 49 35.3636 1,3-二氯苯 421.0 325.8 344.1 308.7 319.7 13.076 0.973 50 35.54 异薄荷酮 18311.7 19006.1 20075.1 18013.6 18654.8 4.241 1.000 51 36.0397 乙位波旁烯 1189.2 1180.9 1380.5 1150.0 1158.3 7.896 0.998 52 36.2026 乙酸异薄荷酯 757.7 766.4 362.4 316.3 311.5 47.226 0.980 53 36.3512 甲位-古芸烯 568.3 21.5 52.8 20.4 21.1 176.620 0.126 54 36.5432 芳樟醇 10250.3 9925.5 13354.1 10647.9 10825.1 12.375 1.000 55 36.7197 反式水合桧烯 121.3 145.8 142.5 136.2 138.0 6.909 0.840 56 36.8477 1-辛醇 349.4 341.0 401.9 335.4 378.9 7.799 0.974 57 36.9225 乙酸芳樟酯 2788.8 2830.0 8091.7 3748.1 3658.9 52.288 1.000 58 37.2467 乙酸薄荷酯 18732.6 18018.6 24740.0 19379.2 19701.7 13.249 1.000 59 37.5183 异胡薄荷醇 9949.3 6586.5 5453.7 9082.7 4535.7 32.628 1.000 60 37.6507 乙位古巴烯 1262.9 1527.0 1612.9 1647.3 1498.8 9.986 0.998 61 37.9977 1,2-丙二醇 47726.1 47520.2 61754.2 59734.7 48063.6 13.491 1.000 62 38.0845 BETA-环柠檬醛 134.8 173.4 158.4 144.3 156.5 9.575 0.859 63 38.0986 乙位榄香烯 94.3 122.7 100.8 120.4 124.4 12.374 0.759 64 38.1543 新薄荷醇 4548.2 4211.8 4463.1 4084.9 4376.8 4.334 1.000 65 38.4078 石竹烯 8313.9 3675.0 3376.1 4376.3 7079.6 41.082 1.000

109 44.9116 香叶醛丙二醇缩醛P2 241.0 239.2 240.6 236.4 249.0 1.945 0.918 110 45.0183 苯甲醇 13.7 29.1 42.8 15.2 14.3 55.459 0.536 111 45.8175 苯乙醇 84.6 82.9 122.7 92.0 82.7 18.351 0.582 112 46.1506 甲位去二氢菖蒲烯 11.8 12.3 34.0 29.1 16.8 48.851 0.606 113 46.3485 去氢柠檬醛 70.1 73.8 117.4 83.7 84.7 21.738 0.529 114 46.6354 茉莉酮 410.4 431.6 591.8 463.2 465.5 14.928 0.975 115 47.6974 石竹烯氧化物P2 429.4 364.4 649.0 496.1 452.5 22.292 0.973 116 48.1328 反式橙花叔醇 37.4 43.9 82.3 53.9 63.1 31.388 0.331 117 48.4813 对甲氧基苯甲醛 2410.0 2402.5 3321.4 5174.9 5239.4 38.207 0.999 118 49.4872 绿花白千层醇 122.1 115.0 146.3 128.8 138.6 9.607 0.715 119 50.1842 斯巴醇 131.5 131.3 175.0 157.6 155.9 12.468 0.764 120 50.9901 丁香酚 3662.3 3664.8 5030.0 20.8 4113.5 58.068 0.377 121 51.0604 百里香酚（麝香草酚） 12734.0 12521.4 16538.9 17249.6 13747.9 15.088 1.000 122 53.1888 香芹酚 40.3 36.5 825.6 55.0 60.5 170.871 0.204 123 54.2563 薄荷内酯 88.7 88.4 132.9 57.8 105.5 28.979 0.469

由表1结果可知，5个薄荷香精样品具有123种挥发性香气成分。其中，薄荷脑是薄荷香精中主要特征挥发性香气成分，具有凉的、清鲜的、愉快的薄荷特征香气，其它主要成分包括茴香脑、香芹酮、薄荷酮、异薄荷酮、桉叶油素、乙酸薄荷酯和 1,2-丙二醇等。其中香芹酮为留兰香型，桉叶油素具有清凉尖刺的类似樟脑样的药草香，薄荷酮、异薄荷酮、乙酸薄荷酯具有清凉的薄荷香气，木香底蕴。

五个薄荷香精的123种挥发性物质间的相对标准偏差和相关系数如表 2所列。其中，2-蒎烯、2-甲基丁酸乙酯、乙位蒎烯、桧烯等40种物质的相似度高于0.99，这 40个峰可用作薄荷香精的特征指纹峰。40种特征指纹峰中，RSD＜10%的有 9种，10%～20%之间的有12种，RSD＞20%的有19种，说明不同批次间的样品质量会有一定的波动。

2.4 聚类分析

图3 5个薄荷香精样品的系统聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis for the 5 peppermint flavors

本研究采用聚类分析对5个薄荷香精样品的挥发性风味成分进行分析，从而对比5个薄荷香精样品间的相似性和差异性，结果见图3。

系统聚类分析树状图中横坐标表示临界值，即平方Euclidean距离（E值），临界值越小，则表明相似度越高；纵坐标为样品名。在图3中可知，当E值为1时，样品4和样品5就已经表现出了较高的相似度，说明样品4和样品5之间存在相同的质量品质；当E值为4时，样品1和样品2相似度较高，品质相同，同时区别于样品4和样品5的品质；当E值为8时，样品1和样品4表现出相似度；当E值为25时，样品3和样品5才表现出相似性，证明3号样品与其他四个样品相似度最差，即品质差异度最高。

3 结论

本研究用优化的GC-MS方法分析薄荷香精中主要挥发性香气物质，结果显示：所分析的5个同公司不同批次的薄荷香精样品，其共同成分有123种；其中，薄荷脑、大茴香脑、香芹酮、薄荷酮为主要香气物质。相似度分析得到2-蒎烯等40种物质可用作薄荷香精的特征指纹峰。相对标准偏差分析结合聚类分析表明不同批次间的样品质量会有一定的波动。本研究采用的GC-MS结合聚类分析方法可以对薄荷香精的品质稳定性可以进行有效且明显的区分控制。