全细胞SELEX法筛选单增李斯特菌的ssDNA适配体

孙程，徐宝霞，徐珍霞，陈福生，吴仁蔚

（华中农业大学食品科学与技术学院，湖北武汉 430070）

李斯特菌属共有17个种菌[1]，只有单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）对人具有致病性，能引起严重的李斯特菌病[2]，病死率高达20%～30%，特别是对孕妇、新生儿、年老体弱和免疫缺陷的人危害更大[3～5]。它引起的散发与爆发性病例绝大多数与食品受到污染有关，一般与即食食品也包括二次污染的烹饪食物有关，已报道的有乳制品、肉制品、冷冻食品、鲜切果蔬，甚至冰激凌等[6～10]，在多个国家和地区都引起过李斯特菌食物中毒事件。该菌被世界卫生 组织列为四大食源性病原菌之一，在美国位居微生物引起的食源性致死病例第三位，自2000年在欧洲的发病也呈逐年增高的趋势[11]。各国政府和国际组织都制定了严格的食品安全限量标准[12～14]。

为了减少单增李斯特菌引起的食物中毒事件的发生，对食品和生产环境进行监测是必不可少的手段。随着科学技术的发展，各种新型检测方法和检测试剂不断被开发和应用。适配体，一种能够特异性识别靶标的新型配体，有望成为生物抗体的替代物，受到国内外学者的高度关注。适配体是从合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的能与靶分子特异性结合的单链DNA或RNA[15,16]。无论作为治疗、诊断还是检测试剂，适配体都具有独特的优势。如库容量大；靶分子范围广，包括真核细胞、蛋白质、细菌、病毒、核酸和小分子物质等[17]；识别抗原结构精细，可以区分结构类似物或交叉抗原的鉴别诊断[18]；性质稳定，对酸碱和热有很好的耐受性；可以连接染料、药物、多肽、蛋白、金属离子、抗体和酶等以满足不同使用目的；无需使用实验动物，可通过化学合成法无限获取并且批次间差异小[19]。所以有关适配体筛选方法、构效关系及其应用方面的研究进展飞速[20～24]。

本研究以单增李斯特菌为靶标，采用全细胞SELEX技术筛选ssDNA适配体，经序列测定、二级结构分析，以及ELASA法进行分析，以获得特异性好、亲和力高的适配体，为开发单增李斯特菌的富集和检测方法提供新型试剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 ssDNA文库与引物

ssDNA长85 bp，两端为引物序列，中间为随机序列，序列为 5'-AAGGATCCGAACGCTGCTGGT AT--(N40)--AGTGTTGAGCGGCGGAATTCAT-3'。引物：引物Ⅰ5'-AAGGATCCGAACGCTGCTGGTAT-3'；

引物Ⅱ5'-CGCCGCTCAACACTGAATTCAT-3'；

引 物 Ⅲ5'-(Digoxin)AAGGATCCGAACGCTG CTGGTAT-3'；

引 物 Ⅳ5'-(Biotin)CGCCGCTCAACACTGAAT TCAT-3'。

ssDNA文库与引物均由生工生物工程技术服务有限公司（上海）合成，引物Ⅲ和引物Ⅳ分别做地高辛和生物素标记。

1.1.2 实验用菌株

单增李斯特菌C53004-1598由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。单增李斯特菌ATCC15313、绵羊李斯特菌（L. ivanovii）ATCC 19119、格氏李斯特菌（L. grayi）ATCC25401、英诺克李斯特菌(L. innocua)ATCC 33090、 威 尔 氏 李 斯 特 菌(L.welshimeri)ATCC35897、西李氏李斯特菌(L.seeligeri)ATCC35967均由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.3 主要试剂

小分子量DNA纯化试剂盒为美国Mobio公司产品；抗地高辛抗体碱性磷酸酶为Roche公司产品；链霉亲和素磁珠M-280为Invitrogen公司产品；质粒提取试剂盒；PCR相关试剂和pMD18-T vector均为北京天根生化科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 SELEX 筛选过程[16]

取100 µmol/L 的ssDNA 文库6 µL 加到600 µL选择缓冲液的EP管中，96 ℃变性5 min后立即冰浴。与108CFU/mL菌液120 μL混合后于室温震荡结合1 h。12000 r/min，4 ℃离心 5 min，弃上清。600 µL 选择缓冲液重悬沉淀，重复洗涤后ssDNA与菌体结合物用 100 µL 无菌 ddH2O 于 96 ℃加热 3 min，离心后吸取上清液获得次级文库，为了获得特异性强亲和力高的适配体，对筛选过程进行不断调整（表1），同时进行反相筛选去除与EP管表面结合的ssDNA。重复上述步骤循环筛选。

表1 SELEX的筛选条件Table 1 Condition of SELEX selection

1.2.2 次级文库的制备

1～15轮筛选过程中加热洗脱的次级文库引物Ⅰ和引物Ⅳ进行PCR扩增以增加产量，对PCR的退火温度和模板量两个因素进行了优化。反应体系为2×Taq PCR Mix 15 μL、10 μM 上下游引物各 1 μL、模板（即筛选的次级文库）、去离子水补足体积。PCR反应条件为 94 ℃变性 45 s，不同温度退火 45 s，72 ℃延伸45 s。PCR产物经10%非变性SDS-PAGE凝胶电泳进行检测，然后进行硝酸银染色观察。链霉亲和素磁珠M-280去除互补链（操作过程按照说明书进行），得到ssDNA次级文库，用于下一轮筛选。

1.2.3 次级文库结合能力的测定[21]

筛选得到的 ssDNA次级文库用引物Ⅲ和引物Ⅳ扩增，扩增产物利用M-280磁珠吸附去除生物素标记的互补链后，获得地高辛标记的ssDNA，将100 pmol ssDNA 与1.6×1010CFU 单增李斯特菌在500 µL选择缓冲液中结合 30 min，12000 r/min 4 ℃离心 5 min，弃上清。加入100 µL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体37 ℃反应 30 min，12000 r/min 4 ℃离心 5 min，弃上清，重复洗涤 3 次。加 100 µLρ-NPP 溶液显色，2 mol/L氢氧化钠100 µL终止反应，酶标仪测定405 nm的吸光度值（A405 nm）。评价各轮筛选的次级文库与靶标的结合能力。

1.2.4 适配体结构分析

最终获得的ssDNA文库经扩增后连接pMD-18T载体，转化埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子由生工生物有限公司测序。将测序获得的 23条适配体序列经DNAMAN和RNA Structure分析一级结构的同源性和预测二级结构。

1.2.5 适配体与靶标的结合能力与特异性分析

合成23条适配体，按照1.2.3方法以ELASA法测定其与单增李斯特菌的结合能力，以及识别不同种李斯特菌与非李斯特菌的特异性。每个实验重复3次，经独立样本T检验，在α=0.01的水平上对适配体识别单增李斯特菌与其它细菌的特异性进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增条件的确定

图1 PCR扩增次级文库的反应条件Fig.1 Reaction condition of sub-library amplification by PCR

本研究主要对 PCR扩增的退火温度和模板量进行了优化，结果见图1。随着退火温度升高产物增加，至72 ℃达到最大。在ssDNA模板量为1 pmol时PCR产物电泳条带整齐，没有拖尾弥散，随着模板量增加dsDNA没有明显增加，ssDNA增多，说明在当前PCR反应体系中加入的ssDNA模板过剩。所以在本次PCR反应体系中ssDNA模板使用量为1 pmol，反应的退火温度采用72 ℃。

2.2 SELEX过程次级文库的富集

图2 ELASA测定次级文库的富集Fig.2 Enrichment of ssDNA sub-libraries evaluated by ELASA

图2显示ELASA法测得的次级文库与单增李斯特菌结合的吸光度值。A405nm从第1轮的0.051到第15轮的0.69，提高了13.5倍，说明随着筛选轮数的增加二者的结合能力不断增强，特异性的适配体不断得到富集，13轮到15轮的结果表明次级文库的结合趋于饱和。

2.3 适配体序列及二级结构预测

图3 RNA Structure预测适配体二级结构Fig.3 Secondary structures of aptamers predicted by RNA Structure

测序共获得 23条适配体，随机序列区见表 2，DNAMAN分析适配体随机序列非常多样化，在随机序列区最多有8个连续相同的碱基，如适配体10和45有相同序列-TGGCCAAC-，适配体7和32有相同序列-TTTTTTTT-，其次为适配体 29、43和 44有7个连续相同的碱基-TCGGGGA-其余适配体之间连续相同碱基序列较少。

RNA Structure进行二级结构预测,以自由能最低作为适配体的二级结构，结果发现一些序列不同的适配体二级结构却相似，根据二级结构的相似性将 23条适配体分为A、B、C3个群，取每个群自由能最低的适配体结构作为代表（见图3）。A群适配体所占比例最高（12/23），有口袋结构，连续的茎环和发夹结构。B群适配体所占比例最少（3/23），似乎有2个分开的茎环结构。C群（8/23）有多个茎环结构，口袋结构。

2.4 适配体与靶标的结合能力与特异性分析

ELASA法测定23条适配体与单增李斯特菌的结合能力，结果见表 2，说明经过多轮筛选亲和力较高的适配体得到富集，但不同的适配体结合能力有差异。靶标的结合能力与其二级结构有相关性。

选取的21和35号适配体特异性分析结果见图4，其不仅能识别筛选用菌株，而且能识别其它单增李斯特菌菌株，且相比于其它种李斯特菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的识别能力差异极显著(p＜0.01，n=3)，说明这2条适配体能特异性识别单增李斯特菌。这为特异性富集和检测单增李斯特菌奠定重要基础。

图4 21号和35号适配体的特异性Fig.4 Specificity of aptamers Lma-21 and Lma-35

表2 适配体特性分析Table 2 The characteristic of aptamers

3 讨论

3.1 全细胞SELEX是以整个真核或原核细胞作为筛选的靶标，细胞表面蛋白和一些未知的结构都可以是适配体结合的目标。通过这种方法筛选适配体不需要对表面蛋白有太多的了解，这反而有助于发现用于诊断和成像的新型生物标志物[17]。而且采用全细胞作为靶标，通常细胞不固定，可以保持抗原决定簇的天然结构不发生变化。该方法在筛选病原菌的适配体方面具有优势[25]。

3.2 虽然李斯特菌属中只有单增李斯特菌对人具有致病性，但由于他们的生理生化特性和在环境中的存活能力相似，因此其它几种李斯特菌的检出可能意味着有单增李斯特菌的存在或者说明环境条件允许单增李斯特菌的存在、生长，因此一定程度上具有指征作用[26,27]。本研究在适配体筛选过程中采用全细胞作为靶标，目的是尽可能保持抗原决定簇的天然结构不发生变化，而且在筛选过程中未对其它李斯特菌进行反向筛选，目的是能够同时获得具有属特异性和种特异性的适配体。Lma-21和Lma-35适配体表现出特异性识别单增李斯特菌的能力，而李斯特菌属特异性适配体结果将在后续进行深入研究，该研究对后续开展以适配体进行菌体富集和检测的研究具有重要意义。 3.3 本研究获得的适配体，通过软件分析，序列同源性不高，分析原因可能是筛选过程使用的靶标是全细胞，菌体表面存在较多的抗原表位，而适配体识别抗原表位极为精细，甚至咖啡因和茶碱这样的结构类似物也能被识别[18]，这增加了与靶标结合的适配体库的丰度，造成适配体序列同源性不高。此结果与Duan[28]的结果吻合。

3.4 在进行二级结构分析时发现，一些序列不同的适配体二级结构却相似。Heiat等[23]也发现不同适配体序列可以形成相似的二级结构，而且与靶标的亲和力有差异，他们认为仅仅分析序列同源性和二级结构都不能很好地阐明适配体与靶标的相互作用。许多学者对适配体的高级结构进行了深入研究，普遍认为它们的分子间作用包括精密的平面叠加，特异性的氢键结合和分子形状的互补等，这种识别的基本原理与许多细胞识别、生物抗体以及核酸识别是一致的[23,24]。笔者正对筛选得到的适配体高级结构进行分析，以明确适配体识别抗原位点的分子基础和核心序列，为修饰适配体，提高特异性和亲和力提供参考。

4 结论

本研究以单增李斯特菌为靶标，采用全细胞SELEX技术筛选ssDNA适配体，经序列测定和二级结构分析表明适配体的高级结构与其识别靶标的能力明显相关。经ELASA法分析，获得了能特异性识别单增李斯特菌的适配体，且亲和力高。本研究为后续开发富集和检测方法提供了可持续获取的基础材料，弥补了生物抗体的一些不足之处。