添加不同水平NaCI对蛋黄浆质凝胶性的影响研究

杨海燕，金永国，孙秀秀，靳国锋，马美湖

（华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430070）

咸蛋是我国乃至东南亚地区的一种传统腌制蛋制品，因其独特的口感和风味受到广大消费者的喜爱，是人们日常饮食中的一种重要食品。在咸蛋中蛋黄是消费者最喜爱食用的部分，也是咸蛋品质好坏的重要评价部位。一般好的咸蛋要求蛋黄“鲜、细、嫩、松、沙、油”。目前，由于市场的广泛需求，蛋黄会被直接 腌制成咸蛋黄，大量用于蛋黄包、粽子、月饼等中式食品中[1,2]。

蛋黄是一种O/W的乳状液，溶解相为浆质，其余的则为悬浮的颗粒，适度离心得到浆质和颗粒成分[3,4]；浆质占蛋黄干物质的77%～81%，其中包括85%的低密度脂蛋白和15%的卵黄球蛋白[5]；而在咸蛋及咸蛋黄腌制过程中，在 NaCl的作用下，蛋黄内原本分布均匀的乳化型细小脂肪珠分离析出，水分向外扩散，亲油基团相互聚合，蛋黄中稳定的乳状液体系被破坏，最终形成的咸蛋黄丰润鲜红、油露松沙、营养丰富[6,7]。目前多数研究集中于腌制方法和工艺研究，而对于腌制过程中单就蛋黄浆质及其凝胶特性的研究较少[8,9]；例如，关于蛋黄浆质Anton等[3]人的研究中发现蛋黄浆质乳化性高于颗粒；Sirvente等[11]人研究发现高压显著影响浆质乳化性，但并不改变浆质流变特性[10]；孙嘉文等研究了冷冻对蛋黄全蛋液、蛋黄颗粒和蛋黄浆质三部分乳化性质的影响，发现蛋黄进行冷冻时，蛋黄颗粒和蛋黄浆质之间可能发生了相互作用，产生分子间和分子内的聚集行为，导致蛋黄经过冷冻后乳化容量以及可溶性蛋白等显著降低；Laca等[12]对蛋黄浆质及颗粒性质的研究中发现，蛋黄颗粒比浆质抵抗热变性的能力强，这是因为浆质中的低密度脂蛋白对热敏感；浆质中的蛋白在蛋黄凝胶中起着重要作用，其凝胶性是禽蛋蛋白较重要的功能特性，研究蛋黄浆质在腌制过程中的凝胶性具有重要意义。本实验旨在研究不同 NaCl浓度下蛋黄浆质凝胶性的影响，观察不同浓度NaCl腌制蛋黄24 h后，蛋黄凝胶保水性、凝胶质构；浆质流变性、粒径分布等，以探讨腌制蛋黄浆质凝胶变化情况，为咸蛋腌制过程中浆质凝胶变化提供理论基础，并为未来蛋品开发提供可能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋（海兰褐壳蛋），购自华中农业大学农贸市场。

NaCl、正己烷均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Sigma 3-30N型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；JSM-6390型扫描电子显微镜，日本 NTC；TA.XT.plus型质构仪，英国 stable micro system；ULtrascan VIS台式分光测色仪，美国Hunter Lab公司；DHR2型流变仪，美国沃特斯公司；APA2000型激光粒度分布仪，英国马尔文仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

新鲜鸡蛋去壳分离蛋清、蛋黄，获得去除蛋黄膜的蛋黄液。采用直接腌制的方法加入NaCl，其中NaCl（NaCl占蛋黄液质量百分比）添加量分别为0%（设为对照组）、0.5%、1.0%、1.5%、2%（咸蛋腌制成熟后，蛋黄含盐量一般为1.5%左右，设为腌制组），在4 ℃条件下腌制24 h；腌制完成后加入1.5倍的蒸馏水，搅拌均匀调节pH=7于4 ℃放置过夜，10000 r/min离心 40 min 获得蛋黄浆质，置于 4 ℃下保存，备用[13]。

1.3.2 浆质凝胶的制备

取15 mL浆质于20 mL塑料杯中，用保鲜膜封口，用橡皮筋扎紧后90 ℃水浴加热40 min，然后取出用自来水冷却20 min，放于4 ℃条件下冷藏过夜。

1.3.3 浆质凝胶保水性的测定

凝胶保水性的测定[12]：将制备好的凝胶置于高速冷冻离心机中，10000 r/min离心10 min后，称总重，去除离心出的水分，再次称重，按照以下公式计算凝胶保水性（water holding capacity，WHC）：

其中W1为离心管和离心除水后的凝胶重，W2为离心前离心管和凝胶重，W为离心管重。每个处理有3个平行。

1.3.4 浆质凝胶质构测定

用质构仪测量蛋黄浆质凝胶质构特性[14]。将样品切成1 cm×1 cm×1 cm 的正方体，并将其中心置于质构仪探头的正下方样品台上，采用P/36R探头对样品进行两次压缩。测定条件如下：测前速度2.0 mm/s；测试速度1.0 mm/s；测后速度2.0 mm/s；压缩百分比50%，触发力1.0 g，触发类型auto数据摄取速率200 pps停留时间5 s。测试完成后，用仪器自带软件内部宏对测试结果进行处理，为了保证测定结果的准确性，质构测定重复10次。得到凝胶硬度（Hardness）、弹性（Springiness）、凝聚性（Cohesiveness）、咀嚼性（Chewiness）等。

1.3.5 浆质成分粒径分布测定

采用MS2000型激光粒度分析仪测定蛋黄浆质中粒度的分布情况。光学参数：相对折射率1.44，粒子吸收0，连续相折射率为1.33。

1.3.6 浆质成分色度测定

采用Ultra Scan VIS型色度仪测定蛋黄浆质的明度（L*）、红绿值（a*）、黄蓝值（b*）。L*值 0～100表示全黑至全白，a*值由小至大表示绿色至红色，b*由小至大表示表示蓝色至黄色。

1.3.7 浆质蛋白SDS-PAGE电泳测定

将样品1:1加入正己烷磁力搅拌30 min，于4 ℃环境中静置4 h后离心除去有机试剂，除去浆质中脂质成分；配置蛋白浓度为2 mg/mL的溶液，取40 μL样品，加10 μL蛋白上样缓冲液，混合均匀后沸水浴煮沸5 min，取20 μL上样。采用浓缩胶5%，分离胶12%进行电泳分析。

1.3.8 浆质成分流变特性测定

采用马尔文旋转流变仪，在25 ℃下，选择0°/40 mm平板系统，1 mm平板间距，固定振荡应力为10%，测定浆质的弹性模量(G')、黏性模量(G")随振荡频率的变化，振荡频率的变化范围为0.1～40 Hz。

1.3.9 扫描电子显微镜观察浆质凝胶结构

浆质凝胶切成1 cm×1 cm×1 cm体积大小块状，50 ℃烘干30 min脱去水分，于中心取样装裱于扫描电镜板上，喷金处理后用扫描电子显微镜观察。

1.3.10 数据分析

所有数据采用WPS office 2016进行统计处理，采用 IBM SPSS Statistics 22对数据进行方差分析，用Origin Pro 8.5 软件作图，以p＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 NaCl处理对蛋黄浆质凝胶保水性的影响

图1 不同NaCI浓度下蛋黄浆质凝胶保水性影响 Fig.1 Effect of different concentration of NaCl treatment on water holding capacity of egg yolk plasma gel

由图1可知，蛋黄浆质凝胶在NaCl添加量为2%时，蛋黄浆质凝胶保水性最好，且与其他处理组凝胶保水性差异显著（p＜0.05），蛋黄浆质凝胶保水性随NaCl浓度的增加而增大。

LI J等[15]研究发现蛋黄凝胶在加入1.8% NaCl后，凝胶保水性从98.70%逐渐增加到99.16%，和本文研究结论一致。这可能是因为 NaCl的加入增加了凝胶内部水的流动性与分布，并使蛋白分子易于形成水离子键，改变凝胶内部疏水相互作用。凝胶的保水性反映了蛋黄浆质对水的保持能力，保水性越高，更好防止水分子的逸出[16]。

2.2 NaCl处理对蛋黄浆质凝胶质构特性影响

由表 1可知，用 0.5%、1%、1.5%、2%浓度的NaCl腌制24 h后，蛋黄浆质凝胶的硬度值均低于对照组，特别是2%浓度的NaCl处理后，蛋黄浆质凝胶硬度比0%对照组显著降低了10.719 N（p＜0.05）；浆质凝胶内聚性随NaCl浓度增加，呈现下降趋势，0.5%、1%及1.5%NaCl组间变化无差异，而2%浓度NaCl处理组差异显著（p＜0.05）；蛋黄浆质凝胶弹性随 NaCl添加量的增大基本不变；腌制组样品的咀嚼性和胶黏性均低于0% NaCl组，但是随着NaCl添加量的增加，未呈现直线下降趋势；综上，2%NaCl添加量时，浆质凝胶质构特性最差，凝胶品质降低。

蛋黄浆质中，低密度脂蛋白含量高达85%，是蛋黄凝胶过程中起主要作用的蛋白质，其他蛋白质并不直接参与蛋黄凝胶作用[17]；在WAKMATU等[18]人的研究中发现，当添加1%～2%NaCl时，形成低密度脂蛋白-水-NaCl复合物，会抑制低密度脂蛋白形成的凝胶，凝胶硬度、内聚性等下降；同时在KITABATAKE等[19]人的研究中发现当NaCl浓度较高时，NaCl使凝胶中出现不溶性凝集物，凝胶强度下降。因此，当添加不同浓度的 NaCl时，维持低密度脂蛋白稳定性的疏水相互作用被破坏，形成低密度脂蛋白-水-NaCl复合物，形成凝胶质构特性下降。

表1 不同NaCI浓度下蛋黄浆质凝胶质构 Table 1 Textural profiles of the egg yolk plasma gel with different concentration of NaCl treatment

2.3 NaCl处理对蛋黄浆质粒径分布的影响

由图2可知，0%、0.5%、1%、1.5%、2% NaCl添加量下蛋黄浆质粒径分布情况。在 NaCl的添加量为0%时，粒径呈现单峰分布，浆质粒径分布在1～100 μm之间，分布较好；这和PILLET E等人测定的蛋黄浆质粒径分布图一致，均呈现较好单峰分布[17]；当加入NaCl后，逐渐出现两个较小的峰，一个分布在1～10 μm，一个分布在100～1000 μm，粒径分布图峰向右移动，部分浆质蛋白发生聚集，粒径变大；同时由于Na+的加入增加了蛋白的溶解性，部分蛋白粒径变小，形成 1～10 μm 的小峰。

图2 不同浓度NaCI处理蛋黄浆质粒径分布图 Fig.2 Particle size distribution of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

粒径的分布反应了蛋黄浆质的稳定性，Na+的作用使蛋黄的稳定性破坏，当 NaCl浓度过高时，连接蛋黄颗粒高密度脂蛋白和卵黄磷蛋白的钙磷桥被 Na+破坏，颗粒蛋白溶解度可达到80%以上，蛋黄稀释静置后浆质与颗粒形成较为明显的分层，产生如图4所示现象，在MCBEE L E等人最为经典的蛋黄浆质与颗粒分离法中，选用0.17 M的NaCl作为稀释剂[20]，可见一定浓度的NaCl会影响浆质溶液的稳定性。

2.4 NaCl处理对蛋黄浆质色度影响

图3 不同NaCI浓度下蛋黄稀释静置图 Fig.3 Diluting statics of egg yolk solution with different concentration of NaCl treatment

从表2可以看出，随着NaCl浓度的增加，蛋黄浆质明度L*增加，浆质颜色逐渐偏向红黄色，其色泽整体变深。蛋黄的颜色是由于脂溶性类胡萝卜素（叶黄素，包括玉米黄素、β-隐黄素以及少量的β-胡萝卜素）的存在，其中脂类集中在蛋黄浆质中[21]，腌制会使蛋黄中脂质浸出，脂溶性类胡萝卜素溶解量加大，浆质颜色由淡黄色变黄色、橙黄色，图3中可以明显看出蛋黄浆质色度变化。

蒋劲松对咸蛋黄分离腌制过程中，也发现蛋黄明度随腌制时间延长、腌制液浓度增加，明度增加，是因为游离脂肪酸的析出[22]；吴玲部分替代 NaCl腌制对蛋黄色度的变化中，蛋黄颜色由鲜鸭蛋的亮黄色变红黄后逐渐变暗变深，当咸蛋腌制成熟时，L*值变化较为缓慢[23]，咸蛋腌制完成；腌制过程中，NaCl的脱水作用也会使蛋黄色素变浓，颜色变深。不同 NaCl浓度下蛋黄浆质色度变化，反映了蛋黄在腌制过程中盐浓度越高，游离脂肪酸析出越多，脂溶性类胡萝卜素溶解增加，使得蛋黄浆质明度增加，颜色偏向红黄色。浆质色度的变化体现着浆质中脂质变化、咸蛋腌制状态，而脂质在蛋黄浆质凝胶网络的形成中起到了填充作用，部分促进了凝胶品质形成。

表2 不同NaCI浓度下蛋黄浆质色度变化 Table 2 Values of L*, a* and b* colour coordinates for the eggs yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.5 NaCl处理对蛋黄浆质蛋白影响

通过SDS-PAGE凝胶电泳分析NaCl对蛋黄浆质蛋白条带的影响。通过以标准蛋白的相对迁移做为对照，可以看出蛋黄浆质中主要为低密度脂蛋白和卵黄蛋白，分子量 175 ku、140 ku、70 ku、15 ku 为低密度脂蛋白的脱辅基蛋白质[24]，卵黄蛋白有三个异构体，分别为α、β、γ，分子量为 85 ku、42 ku、65 ku，这和AMANDA关于蛋黄浆质的SDS-PAGE图一致[21]。蛋白样品经过 NaCl处理后，蛋白质条带没有明显变化，说明实验过程中 NaCl对蛋黄浆质的一级结构并不造成影响。郑华等的研究也表明，腌制过程中尽管食盐对蛋黄蛋白质的空间结构造成了一定程度的改变，但并未对蛋白质的肽链结构发生作用[6]；则NaCl处理，并未对蛋黄浆质凝胶蛋白质肽链结构造成影响。

图4 不同NaCI浓度下蛋黄浆质SDS-PAGE图 Fig.4 SDS-PAGE patterns of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.6 NaCl处理对蛋黄浆质流变特性影响

图5为不同腌制浓度下蛋黄浆质的G’和G’的扫描频率图，对于某一确定粘弹性体系，G’与体系中交联、缠结或聚集的弹性组分成比例；G’与体系中粘性成分有关；G’和 G’可作为评价粘弹性流体弹性以及粘性的大小。

图5中蛋黄浆质所有样品的G’和G’均随着扫描频率的增加而增加，且G’大于G’，可知蛋黄浆质是弹性流体，这和WANG YL等[26]人研究结果一致；图5中蛋黄腌制时间24 h后，腌制蛋黄浆质储能模量较新鲜蛋黄浆质均下降，NaCl浓度升高，腌制蛋黄浆质储能模量升高，体系中交联、聚集的弹性成分增加；损失模量在 NaCl的作用下变化较小，蛋黄浆质粘性降低较少。

在蛋黄浆质中含有较多的低密度脂蛋白，低密度脂蛋白悬浮在蛋黄溶液中，其具有形成凝胶的能力，当经过一段时间的腌制后，咸蛋黄转变为弹性凝胶[27]。KAEWMANEE等[28]人的研究中也发现，当NaCl添加量为1.5%时，蛋黄由溶胶转变为凝胶，蛋黄中浆质流变学行为发生变化。AMANDA[21]对新鲜蛋黄浆质中成分（lipidic paste）及颗粒进行了频率扫描，发现其G’及G’同样随着扫描频率的增加而增加，且tanδ小于1，呈现类固体的性质；因此，当NaCl腌制24 h处理后，蛋黄浆质凝胶G’和G’均低于未处理组，形成凝胶交联程度降低，凝胶性能下降；而当 NaCl浓度增加至一定值时，形成凝胶交联聚集弹性成分增加，凝胶性能相对增强。

图5 不同NaCI浓度蛋黄浆质储能模量（G′）与损失模量（G′′）变化 Fig.5 The changes of storage modulus (G’) and loss modulus(G’) of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.7 NaCl处理对蛋黄浆质凝胶微观结构影响

不同浓度 NaCl处理，蛋黄浆质凝胶扫描电镜图（Scanning electron microscopy，SEM）如图 6 所示，从图中可以看出蛋黄浆质凝胶中不规则蛋白分布；NaCl添加量为0%时，凝胶中蛋白呈现较小的粒径，当 NaCl添加量增加时，蛋黄浆质凝胶中部分蛋白颗粒粒径变大，这和浆质粒径测量是一致的（图2）；当NaCl添加到蛋黄中，蛋黄中的脂质成分游离出来，覆盖到蛋白表面，将蛋白中的孔洞填补，使得浆质凝胶表面更为紧缩、纹理粗糙，同时 NaCl的脱水作用使得这一现象更为明显；AMANDA等[21]人的对新鲜蛋黄浆质组分的 SEM 图中，脂质和蛋白在浆质组分中也呈现不规则的块状分布。

图6 不同浓度NaCI处理蛋黄浆质扫描电镜图 Fig.6 Scanning electron microscopy of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

3 结论

本实验通过对蛋黄分离腌制，运用多种分析检测手段，分析 NaCl处理后蛋黄浆质色度、粒径分布、流变性以及浆质蛋白分布，蛋黄浆质凝胶的保水性、凝胶质地结构特性以及凝胶微观结构，来研究 NaCl处理对蛋黄浆质凝胶的影响。主要研究结果如下：随着NaCl添加量由0%增加至2%，蛋黄浆质保水性随NaCl浓度的增加而显著增大（p＜0.05）；浆质凝胶硬度、咀嚼性、内聚性均在 NaCl的作用下，凝胶系数下降，而弹性基本不变；流变学研究表明，蛋黄浆质是弹性流体，一定量 NaCl腌制后，蛋黄浆质凝胶性能下降；NaCl的作用会影响蛋黄浆质粒径分布，使部分蛋白分子产生聚集，粒径变大；而对蛋白质肽链结构并不造成影响；NaCl处理后蛋黄浆质中蛋白、脂质随着盐的不断渗入，蛋黄脱水，脂质不断分解，凝胶结构发生改变，蛋白粒径变大，结构粗糙，而游离出来的脂质会使凝胶中蛋白颗粒包裹起来形成皱缩状态。因此，0.5%、1%、1.5%、2%浓度NaCl腌制蛋黄，不仅降低了蛋黄浆质形成凝胶质构特性，而且形成凝胶特性下降。