江苏省鸡肉产品中弯曲菌耐药特征及Ⅰ型整合子分析

唐梦君，周倩，张小燕，张静，唐修君，陆俊贤，周生，黄胜海，杨星星，高玉时

（江苏省家禽科学研究所，江苏扬州 225125）

弯曲菌（Campylobacter）是全球范围内主要的人兽共患、细菌性肠道病原菌，导致人致病的弯曲菌中85%以上是空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），其次是结肠弯曲菌（Campylobacter coli，C.coli）[1,2]，主要引起人的胃肠炎，临床症状从水样腹泻到血便，同时伴有头疼、腹痛、发热，偶有呕吐[3,4]。据美国国家食品网监测，弯曲菌引起的人类肠道感染仅次于沙门氏菌，每年都有大量的发病率和死亡病例[5,6]。

由于弯曲菌能够在家禽肠道内大量定植，家禽感染后不表现出任何临床症状，但可持续向外界排菌且终生带菌[7]。在屠宰加工的过程中如果肠道破裂，很容易污染屠宰场地、设施和水，从而污染禽肉产品[8,9]。世界流行疾病研究指出弯曲菌主要由食品传染，禽肉产品是主要的传染源[10]。

近年来，抗生素在食品源动物生产上的不合理使用，导致弯曲菌的耐药性逐步增强，耐药谱逐渐加宽。整合子作为介导细菌耐药性播撒的可转移遗传元件之一，能够捕获外源耐药基因并将其水平传播，从而使耐药现象更加严重[11,12]。整合子结构主要包括5’保守区 (5’-conserved segment ， 5’-CS) 、 3’保 守 区(3’-conserved segment，3’-CS)以及中间的可变区(variable region，VR)。国内外学者研究表明，在革兰氏阴性菌中整合子的存在与多重耐药有密切的关系，弯曲菌也有报道检测出Ⅰ型整合子[13]。由于食品源耐药菌和耐药基因可以通过食物链传播给人类，因此，给人类健康和食品安全构成潜在威胁。

本研究以江苏省鸡肉产品中分离的 95株弯曲菌为研究对象，对其耐药表型、Ⅰ型整合酶基因（int1）、3’-CS及携带的基因盒进行检测，以便更好地了解弯曲菌耐药性的产生和传播途径，为控制耐药性细菌的产生和传播提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2016年6月～2017年4月，从江苏省扬州、徐州、宿迁和盐城等各市县的农贸市场和超市采取鸡肉样共270份，分离鉴定出空肠弯曲菌（C. jejuni）70株，结肠弯曲菌（C. coli）25株，其弯曲菌分离鉴定方法见文献[14,15]。空肠弯曲菌标准菌株（NCTC11168）、结肠弯曲菌标准菌株（ATCC33559）由本室保存，大肠埃希氏菌ATCC25922由扬州大学兽医学院惠赠。

1.1.2 培养基与试剂

培养基：Cary-Blair运送培养基、CCDA培养基、MH培养基、BHI培养基均购自于英国OXOID公司；弯曲菌分离用抗生素三甲氧苄氨嘧啶、头孢哌酮、多粘菌素 B、两性霉素 B、利福平和放线菌酮等购自WAKO公司；脱纤维绵羊血购买于青岛海博生物技术有限公司；厌氧罐购自日本MGC公司；混合气（5%O2、10%CO2和85%N2）购于南京特种气体厂有限公司；试剂：Ex Taq premix、DL2000 Marker均购自大连宝生物；细菌DNA提取试剂盒购自上海生工；其它均为试验常规试剂。

表1 PCR检测Ⅰ类整合子所用引物Table 1 Primers for amplification of class Ⅰ integron detected by PCR

1.1.3 药敏纸片

共选择9大类抗生素中的21种常规药敏纸片，包括 β-内酰胺类的氨苄西林（Ampicillin，AMP，10 μg）、阿莫西林(Amoxicillin，AML，10 μg)、第三代头孢中的头孢噻肟（Cefotaxime，CTX，30 μg）；碳青霉烯类亚胺培南（Imipenem，IPM，10 μg）和美罗培南（Meropenem，MEM，10 μg）；氨基糖苷类有链霉素（Streptomycin，S，10 μg）、庆大霉素(Gentamicin，CN，10 μg)、阿米卡星(Amikacin，AK，30 μg)、妥布霉素(Tobramycin，TOB，10 μg)和卡那霉素（Kanamycin，K，30 μg）；喹诺酮类有萘啶酸（Nalidixic acid，N，30 μg）、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP，5 μg)、氧氟沙星(Ofloxacin，LEV，5 μg)和恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR，5 μg）；大环内酯类有红霉素（Erythromycin，E，15 μg）和阿奇霉素(Azithromycin，AZM，15 μg)；四环素类有四环素(Tetracycline，TE，30 μg)；洁霉素类有克林霉素(Clindamycin，DA，2 μg)；酰胺醇类有氟苯尼考（Florfenicol，FF，30 μg）和氯霉素（Chloramphenicol，C，30 μg）；多磷类有磷霉素（Fosfomycin，FOS，10 μg），以上药敏纸片均购买于英国OXOID公司。

1.1.4 PCR扩增引物

Ⅰ型整合酶基因（int1）、3’-CS以及可变区扩增引物，根据GenBank上登录的基因序列（KC493654），利用Primer Premier 5.0软件自行设计。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 弯曲菌耐药性表型检测

采用WHO推荐使用的Kirby-Bauer法（纸片琼脂扩散法）检测95株分离株对21种抗生素的敏感性。其操作步骤如下：用无菌棉签从MH平板上刮取纯化培养的细菌至500 µL PBS缓冲液中，将菌液稀释至0.5麦氏浊度，取 100 µL稀释后的菌液均匀涂布于MH平板，用无菌镊子贴上药敏纸片，于42 ℃微需氧培养36～48 h后取出，用直尺测定抑菌圈直径（mm），结果判定参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2015）的标准，以抑菌圈直径大小判断耐药（resistant）、中敏（intermediate）和敏感（susceptible）。数据采用Excel 2015整理分析。

1.2.2 细菌DNA模板的制备

将MH血平板纯化培养的细菌用无菌棉签刮下洗入PBS缓冲溶液，离心后去除上层液体，采用试剂盒提取基因组DNA。

1.2.3 Ⅰ型整合酶基因（int1）及3'-CS的检测

采用25 μL PCR反应体系：Ex Taq premix 12.5 μL，上下游引物（10 μM/L）各1 μL，无菌去离子水9.5 μL，模板 DNA 1 μL。

PCR反应条件为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，根据不同引物选择相应的退火温度，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳成像。选取PCR阳性样品送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果在NCBI上进行BLAST分析。

1.2.4 Ⅰ型整合子可变区的检测

采用50 μL PCR反应体系：SpeedSTAR HS DNA Polymerase (5 units/μL) 0.25 μL，上下游引物（10 μM/L）各 2 μL，10×Fast Buffer Ⅰ或Ⅱ 5 μL，模板 DNA 2 μL，无菌去离子水38.75 μL。PCR循环参数：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳成像。对PCR扩增阳性片段参照TakaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0进行纯化，将纯化产物3 μL、pMD20-T载体 1 μL、连接 Buffer 5 μL、T4 DNA Ligase 1 μL，混匀后于16 ℃反应过夜；将连接产物转化DH5α感受态细胞，上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果在GenBank数据库中采用BLAST软件进行同源性分析。

2 结果与讨论

2.1 95株弯曲杆菌分离株耐药表型测定结果

图1 弯曲菌分离株对21种抗生素的多重耐药谱Fig.1 Multi-drug resistance profiles of Campylobacter isolates to 21 antimicrobial agents

药敏试验结果显示，从鸡肉产品中分离的弯曲菌普遍对环丙沙星、头孢噻肟、氧氟沙星、卡那霉素、氨苄西林、四环素、萘啶酸、阿莫西林、恩诺沙星、链霉素、妥普霉素和克林霉素等有一定的耐药性(表2)，特别是对环丙沙星、头孢噻肟、卡那霉素、氨苄西林和氧氟沙星的耐药率达到60%以上，但对磷霉素、氯霉素、美罗培南敏感。

其中，空肠弯曲菌对环丙沙星、氧氟沙星、头孢噻肟、氨苄西林高度耐药，其耐药率达到70%以上。而结肠弯曲菌对头孢噻肟、卡那霉素、链霉素、环丙沙星、妥布霉素高度耐药，其耐药率达70%以上。91株弯曲菌分离株至少耐4种以上抗生素，95.78%的分离株为多重耐药菌株（耐3种以上抗生素），最严重可耐16种抗生素，大部分菌株耐7～11种抗生素（见图1），分离菌株表现出耐药谱型的多样性，相同耐药谱型较少。

表2 弯曲菌分离株对抗生素的耐药性Table 2 Results of antimicrobial resistance testing of Campylobacter isolated from chicken meat

2.2 Ⅰ型整合子检测

2.2.1 Ⅰ型整合酶基因（int1）及 3’端的检测结果

图2 部分菌株Ⅰ型整合酶基因PCR产物电泳结果Fig.2 PCR amplification electrophoresis of class Ⅰ integrase gene in Campylobacter isolates

对 95株弯曲菌进行 PCR扩增Ⅰ型整合酶基因（int1），检测到预期条带大小为892 bp（见图2）。将PCR阳性产物进行测序比对，与GenBank中收录的参考序列相同（核酸序列一致性为100%），测序结果鉴定为Ⅰ型整合酶基因，共有45株弯曲菌含有Ⅰ型整合酶基因，其检出率为47.0%，其中含有Ⅰ型整合酶基因的空肠弯曲杆菌有37株，结肠弯曲杆菌有8株。对95株弯曲菌进行PCR扩增3’-CS端，其中有10株弯曲菌检测出了预期条带，大小为642 bp，测序结果鉴定为目的片段（见图3）。

图3 弯曲菌分离株Ⅰ型整合子3’-CS端PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification of class Ⅰ integron 3’-CS region in Campylobacter isolates

2.2.2 Ⅰ型整合子可变区的检测结果

图4 弯曲菌分离株Ⅰ型整合子可变区扩增结果Fig.4 PCR amplification of class I integron gene cassette in Campylobacter isolates

进一步对同时具有Ⅰ型整合酶基因和3’-CS端的10株弯曲菌进行可变区基因盒扩增，共有5株为基因盒阳性菌株，电泳结果见图4，基因盒大小约为1800 bp，与GenBank中GQ214171.1序列的核酸序列一致性为99%，为链霉素耐药的基因盒aadA1，该5株菌药敏结果显示对链霉素均具有耐药性。

弯曲菌是一种人畜共患病原菌，可引起动物和人类发生多种疾病。常见症状为腹泻性肠炎，通常为自限性无需抗生素治疗。但对于病情严重、自身免疫力低下等情况，喹诺酮类和大环内酯类常被作为临床治疗用药[16,17]，氨基糖苷类及四环素类也可用做弯曲菌病的替代药物。而在畜禽的生产过程中，抗生素的广泛应用促使了耐药菌的产生，这些耐药菌通过食物链传递给人类可导致治疗失败。

本研究中弯曲菌的多重耐药率为95.78%，表明在江苏地区鸡源弯曲菌的多重耐药已经相当普遍。在受测试的抗菌药物中，分离株对环丙沙星具有较高的耐药率（83.16%），其原因在于环丙沙星常用于预防和治疗家禽腹泻有关的疾病，导致了耐环丙沙星弯曲菌的产生。研究显示不同国家弯曲菌对环丙沙星的耐药水平并不相同（8%～97.9%）[18,19]，发展中国家较为严重，而发达国家的耐药率则较低。

在加拿大，Claudia Narvaez-Bravo等[20]对从鸡肉产品中分离的弯曲菌进行耐药性检测，其弯曲菌对环丙沙星的耐药率为5.5%。韩国Lim SK等[21]对从鸡胴体中分离的弯曲菌进行耐药性检测，弯曲菌对环丙沙星、萘啶酸都具有较高的耐药水平。在本研究中，弯曲菌对氟苯尼考和磷霉素的耐药率分别为 0.08%和0.011%，具有很高的敏感性，与国内外研究报道弯曲菌对氟苯尼考耐药率普遍较低的结果一致[22,18]。Aguilar-Company J研究报道磷霉素可以有效治疗耐大环内脂类和氟喹诺酮类弯曲菌引起的肠道疾病[23]。

细菌耐药基因的水平传播（Horizontal gene transfer，HGT）使得耐药基因在同种甚至不同种菌株间水平转移，加速了多重耐药菌株的产生。整合子能捕获和整合细菌的耐药基因，是细菌多重耐药性形成和广泛传播的重要机制。近年来，国内外学者在多种耐药细菌中均发现了整合子的存在[22,24,25]，包括弯曲菌。弯曲菌中Ⅰ型整合子的检出率因地区差异而不同，O’Halloran F等在爱尔兰分离到的弯曲菌中，具有完整整合子结构的菌株检出率为 16.4%（62/378）[13]，而Alessandra Piccirillo等从意大利家禽分离的弯曲菌中未检出Ⅰ型和Ⅱ型整合子[26]。Ⅰ型整合子中把int1阳性、可变区阳性及3’-CS阳性的称之为典型Ⅰ型整合子，只有int1阳性的称之为非典型1类整合子。本研究对95株弯曲菌进行Ⅰ型整合子的PCR检测，典型Ⅰ型整合子检测出10株，非典型Ⅰ型整合子35株。对典型Ⅰ型整合子的可变区进行基因扩增，有5株分离株扩增出大小相同的条带，测序鉴定为对氨基糖苷类耐药的基因盒aadA1，该基因盒也存在于大肠杆菌、沙门氏菌等细菌的整合子中[27,28]，说明该基因盒可以在不同细菌间传播，有可能通过食品源动物传递给人类，造成耐药性增加。

3 结论

本试验显示分离株呈现多重耐药性，耐药谱宽，而检出的耐药基因盒比较单一只有氨基糖苷类耐药基因盒，说明在江苏地区Ⅰ型整合子存在于鸡肉产品弯曲菌中，但并不是弯曲菌产生多重耐药的主要因素，很有可能存在其他途径造成耐药，如携带耐药基因的质粒、转座子以及基因岛等。

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