响应面法优化黄金茶总黄酮提取工艺及对胰蛋白酶活性影响的研究

王宁，林小翠，王文君

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌 330045）

黄金茶，学名柳叶腊梅(Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu.)，别名山腊梅，浙南又称石凉茶，香风茶，岩马桑，茅山茶食，属真蕨目、为腊梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus Lindl.)半常绿灌木植物，主要分布于安徽南部、湖北、湖南、浙江和江西等地[1]。山腊梅中含有挥发油、生物碱、黄酮、香豆素、萜类、微量元素、维生素和18种矿物质等天然活性成分[2,3]，因而具有降血糖[4]、免疫调节[5]、抗肿瘤[6]、消脂降压和预防心脑血管疾病等作用[7]。20世纪 70年代起，山蜡梅叶制成的制剂有山蜡梅叶颗粒、山蜡梅叶片、山蜡梅叶胶囊、山蜡梅清感茶和脾胃舒胶囊等各种制剂均已进入市场，其使用量逐年增加，也是畲族群众最常用的畲药之一[2,8]。山蜡梅叶因能祛风解表；芳香化湿；可治疗流感，中暑，慢性支气管炎等症而被《中华本草》收录[8]，并在2014年经国家卫计委批准成为药食同源的新食品原料之一。

黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，实际上是以黄酮为母核衍生的一类黄色色素，即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物，其在植物中主体部分与糖结合成苷类，小部分以苷元形式存在，具有抗心律失常、溶解血栓[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、镇痛和降血脂等作用[12]。如马莹娟等[13]证明柿叶黄酮类化合物能够明显改善亚急性衰老小鼠学习记忆能力，提高脑组织的抗氧化能力，降低脑内炎症水平，具有延缓脑衰老的作用。黄酮类化合物具有很多功能活性，在到达人体各部位之前必然会经过消化道，它与消化酶之间的相互作用将会成为今后研究的热点。胰蛋白酶是存在于人和动物肠道中的一种重要的消化酶，并且是所有胰脏蛋白酶原的共同激活剂[14]。正常情况下胰蛋白酶在血液中的含量非常低，但是胰腺炎、肺气肿、癌症及各种脑血管等疾病患者体内都存在过量的胰蛋白酶，现代医学证明，胰蛋白酶抑制剂对急慢性胰腺炎、肺气肿和出血性休克等疾病有一定的疗效[15]。赵红辉等[16]证明二氢杨梅素的添加量为胰蛋白酶的44倍（摩尔比）时，对胰蛋白酶的催化活性抑制率达到34.8%。植物黄酮是一类潜在的类胰蛋白酶抑制剂；胰蛋白酶既是消化酶，也对机体的新陈代谢起着至关重要的调节作用。初步探究黄金茶中的黄酮对胰蛋白酶的抑制作用，对于临床应用、新药设计具有一定的意义。

近年来，超声技术普遍用于提取植物中天然活性成分，如黄酮[16]、多酚[18]、多糖[19]、氨基酸[20]和果胶[21]等，该法具有耗时短、节省溶剂和降低能源消耗的优点；同时可提高化学动力学、溶解度以及试验的再现性[22]。盛丹丹等通过正交试验优化超声提取黄金茶中总黄酮的工艺[23]。与正交和均匀设计相比，Box-Behnken设计可以评价指标和因素间的非线性关系，使用方便，条件预测性好，对实验影响因素的研究较为全面[24]。

本文以黄金茶为原材料，在单因素和响应面实验设计的基础上对黄金茶中的总黄酮提取工艺进行优化，旨在获得最佳的工艺参数，为黄金茶的综合开发利用提供理论依据。同时初步探究黄金茶总黄酮经聚酰胺树脂，30%乙醇洗脱液纯化后的产物对胰蛋白酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄金茶，采自浙江丽水，粉碎后过60目筛备用；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇，均为国产分析纯；聚酰胺（60~80目），上海摩速科学器材有限公司；芦丁标准品，成都曼思特生物科技有限公司；苯甲酰精胺酰对硝基苯胺（BApNA）、胰蛋白酶、Tris.cl(pH=7.4)，购自北京索莱宝有限公司；冰醋酸、二甲基亚砜（DMSO），西陇科学股份有限公司。

GPX-9248A干燥箱/培养箱(两用)，上海跃进医疗器械厂；AUY120型电子天平，日本岛津有限公司；V-5600可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；M2型酶标仪，美国Molecular Device公司；Scientz-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司HH-60；数显恒温搅拌循环水箱，常州国华电器有限公司；FLB-100型万能高速粉碎机，上海菲力博食品机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

将黄金茶叶子用微型植物试样粉碎机粉碎，过60目筛备用。

将最优工艺提取出的黄酮过聚酰胺树脂纯化，用30%的乙醇洗脱，旋蒸，并冷冻干燥，配制成一系列浓度的样品溶液。

1.2.2 总黄酮含量的测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线制备

根据参考文献[25,26]，精确称取60 ℃下烘干至恒重的芦丁标准品10 mg于小烧杯中，加一定70%的乙醇溶解，转移到25 mL容量瓶中，摇匀并定容，即为0.4 mg/mL的标准溶液。精确吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的标准溶液，分别置于6个25 mL容量瓶中，加5%的亚硝酸钠0.3 mL，静置6 min，再加10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，静置6 min，最后加4%的氢氧化钠溶液4 mL，用70%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后用可见分光光度计在510 nm波长下测定吸光度，绘制芦丁标准曲线。

1.2.2.2 黄金茶中总黄酮得率的测定

准确称取黄金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，加入定量一定浓度的乙醇溶液，在一定超声功率下，超声一定时间，将提取液转移至25 mL容量瓶中，用相应浓度的乙醇定容至刻度，摇匀，过滤。准确吸取1 mL滤液于25 mL容量瓶中，按照标准曲线中的显色方法显色，测定吸光度，根据回归方程，计算总黄酮的含量，得出得率：

式中，c为0.25 g黄金茶粉末经乙醇提取后所得黄酮的浓度（mg/mL）；m为黄金茶粉末的质量（g）。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 超声时间对得率的影响

准确称取黄金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，加入5 mL（1:20）的70%乙醇溶液，超声功率为72 W，分别超声10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，将提取液转移至25 mL容量瓶中，用相应浓度的乙醇定容至刻度，摇匀，过滤。准确吸取1 mL滤液于25 mL容量瓶中，按照1.2.2的方法测定其得率，每组实验重复3次。

1.2.3.2 超声功率对得率的影响

准确称取黄金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，加入70%的乙醇5 mL(即料液比1:20)，分别在功率36、54、72、90、108 W条件下，作用25 min，然后转移至25 mL容量瓶，用相应浓度的乙醇定容，摇匀后过滤。准确吸取1 mL滤液于25 mL容量瓶中，按照1.2.2的方法测定其得率，每组实验重复3次。

1.2.3.3 乙醇提取分数对得率的影响

准确称取黄金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液5 mL，作用25 min，然后转移至25 mL容量瓶，用相应浓度的乙醇定容，摇匀后过滤。分别取滤液1 mL于25 mL容量瓶，按照1.2.2的方法测定其得率，每组实验重复3次。

1.2.3.4 料液比对得率的影响

准确称取黄金茶粉末0.25 g于25 mL容量瓶中，分别加入相应体积60%的乙醇溶液，使其料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，作用25 min，超声功率为72 W，然后转移至25 mL容量瓶，用相应浓度的乙醇定容，摇匀后过滤。分别取滤液 1 mL于25 mL容量瓶，按照1.2.2的方法测定其得率，每组实验重复3次。

1.2.4 响应面实验设计

由单因素实验得到的结果，采用响应面法中的Box-Behnken的中心组合实验，选择对黄金茶总黄酮得率具有显著影响的四个因素：超声时间（A）、超声功率（B）、乙醇体积分数（C）和料液比（D），采用四因素三水平的响应面实验设计，见表1。

表1 Box-Behnken实验设计Table 1 Experimental design of Box-Behnken

1.2.5 纯化后总黄酮对胰蛋白酶活性的影响

据参考文献[27]，试验方法略作调整。胰蛋白酶储存液配制：称取胰蛋白酶 6 mg，溶于 10 mL的Tris-HCl(pH=7.4)缓冲液，其摩尔浓度为1×10-6mol/L。底物配制（现配现用）：称取13 mg的BApNA，溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO），其摩尔浓度为0.03 mol/L。配置33%的冰醋酸。

使用96孔板测定胰蛋白酶活性：先加入50 µL的Tris-HCl，然后加入50 µL的BApNA，再加入50 µL的样品，37 ℃水浴10 min，加入80 µL的胰蛋白酶，37 ℃水浴10 min，期间不断搅拌，最后加入33%的冰醋酸中止反应，并在410 nm处测定吸光度值，所有的试验重复三次。

式中：为AEG样品试验组的吸光度值；ABCG为缓冲溶液代替酶的吸光度值；ANCG为缓冲溶液代替样本的吸光度值；ABG为缓冲溶液代替酶和底物的吸光度值。

1.2.6 数据分析

采用F检验对响应面实验数据进行方差分析以评价模型的统计学意义，数据分析软件采用 Design Expert 8.0.6。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rufin

芦丁标准曲线的绘制以芦丁标准溶液浓度为纵坐标，以吸光度值A为横坐标，绘制芦丁标准曲线的散点图，如图 1，芦丁标准曲线的回归方程为y=0.1782x-0.0065，R2=0.996，表明芦丁标准溶液在0.087~0.302 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 单因素分析

2.2.1 超声时间对黄金茶总黄酮得率的影响

图2 超声时间对黄金茶总黄酮得率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

由图2可得，超声时间在10~25 min之间，黄金茶总黄酮的得率随着超声时间的延长而增加，在 25 min时得率达到最高；之后，总黄酮的得率随着超声时间而略微下降，可能是由于超声波强烈的空化效应、机械振动、破碎作用，导致植物细胞膜破裂，细胞内其他物质如粘液的流出影响了提取效果；另一方面由于超声波的热效应，可能影响了黄酮类物质的稳定性及黄酮类物质在溶剂中达到了饱和。因此，选择超声提取时间为20~30 min进行Box-Behnken实验设计。

2.2.2 超声功率对黄金茶总黄酮得率的影响

图3 超声功率对黄金茶总黄酮得率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic treatment power on total flavonoids yield

由图3可得，当超声功率小于72 W时，总黄酮得率随着功率的增加快速提高，当功率超过72 W之后，其得率逐渐下降。这是因为超声波可以使植物细胞壁形成较多的小孔，增强细胞膜的透性，利于胞内物质的溶出，但是功率过大会对黄酮类物质造成破坏，并且会增加能耗，增加提取成本[24]。因此，选择超声提取功率为54~90 W进行Box-Behnken实验设计。

2.2.3 乙醇提取分数对黄金茶总黄酮得率的影响

图4 乙醇浓度对黄金茶总黄酮得率的影响Fig.4 The effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由图4可得，乙醇体积分数为40%~60%时，提取效果随乙醇浓度的增加而增加，乙醇浓度超过60%时，总黄酮率得率下降。这可能是乙醇体积分数过高，黄金茶的色素、脂溶性物质和糖类及黏性物质等物质大量渗出，影响总黄酮提取，同时破坏了黄酮的稳定性，导致了黄酮得率明显下降[28]。因此，选择乙醇体积分数为50%~70%进行Box-Behnken实验设计。

2.2.4 料液比对黄金茶总黄酮得率的影响

图5 料液比对黄金茶总黄酮得率的影响Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids

由图5可得，料液比在1:10~1:25时，总黄酮得率逐渐升高，当料液比继续增大时，总黄酮得率略有下降。当料液比比较小时，原料中的黄酮不能完全溶解到溶剂中，造成提取不完全、提取效率低。增大溶剂用量可以使内部的植物细胞和外部溶剂之间产生更大的浓度差，有利于黄酮的扩散更迅速地进行，因而具有较高的得率[29]。并且当料液比超过一定范围时，可能使一些杂质溶出，与黄酮类物质竞争溶剂；或者杂质影响黄酮在溶剂中的溶解度。考虑到节能减排、提高效率，选择料液比为1:20~1:30进行Box-Behnken实验设计。

采用Design-Expert 6.0.1软件对表2中数据进行多项式拟合回归，建立多元二次回归模型：Y(%)=-43.055+1.534×A+1.544×C-0.054×D-0.057×A2-0.015×C2-0.019×D2+6.65×10-3×A×C+0.041×A×D，实验因素对得率的影响不单单是线性关系，A、C、D、AC、AD对得率Y的影响非常显著。表3回归统计分析结果表明：模型的F=51.67，p<0.0001，表明实验的二次模型是非常显著的，具有统计学意义。失拟项 p值=0.0912>0.05，决定系数经调整后R2=0.9354，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，即失拟项是不显著的。结果显示此模型与实际结果是非常拟合的，可以科学地表示影响得率的各因素与响应值之间的关系，可用该模型对黄金茶中总黄酮得率进行很好地分析和预测。由表 3可知，乙醇体积分数 C（p<0.0001）极显著，超声时间A（p=0.002）高度显著。二次项A2（p<0.0001），C2（p<0.0001）极显著，D2（p=0.002）高度显著，超声时间和料液比的交互作用极显著。由p值和F值可看出，各因素对黄金茶总黄酮得率影响的顺序为：乙醇体积分数>超声时间>料液比，超声功率对总黄酮的得率无影响效果。两因素的交互作用对总黄酮得率的影响极显著的是：超声时间和料液比的交互作用。

表2 Box-Behnken实验设计及实验数据结果Table 2 Box-Behnken experiment design and the experimental results

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 The variance analysis results of the quadratic regression model

2.3 响应面分析与优化

响应曲面三维图可以直观地反映各因素对响应值的影响程度和因素间的交互作用强弱。等高线的形状反映出交互作用影响效应的强弱与大小。

图6 超声时间与乙醇体积分数交互作用影响总黄酮得率的曲面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of the interaction of ultrasonic time and ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids

图7 超声时间与料液比交互作用影响总黄酮得率的曲面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time on the yield of total flavonoids

椭圆形表示两种因素的交互作用影响显著，而圆形则表示两种因素的交互作用影响不显著[24]。比较图6和图7，发现超声时间与料液比的交互作用比超声时间与乙醇体积分数的交互作用对得率的影响显著。

如图 6，可以看出超声时间与乙醇体积分数对总黄酮得率的交互作用和等高线图，二者的交互作用并不是很显著。将乙醇体积分数固定在60%水平时，总黄酮得率随着超声时间的增加而先增加后降低，当超声时间达25 min最大值后开始降低。在一定范围内，总黄酮得率随着乙醇体积分数的升高而增加，从图 6中也可以看出超声时间对得率的曲线较为陡峭，说明在提取过程中超声时间对得率的影响小于乙醇体积分数。

图7表示超声时间与料液比对黄金茶总黄酮得率的交互作用的影响效应。其等高线图表明料液比与超声时间的交互作用影响显著。当把料液比固定在1:20水平上时，随着超声时间的增加，总黄酮得率呈现先增大后减小的趋势，在25 min左右，总黄酮得率达到最大点，随着时间增加，而略有降低。可能由于超声波对植物细胞膜振裂的累加作用，粘液等杂质的溢出相应增加，使浸提液粘度增大，扩散速度降低，影响总黄酮的得率。

2.4 最佳工艺的预测和验证

利用Design-expert 8.0.6的optimization功能，将总黄酮得率的Goal选项选择为maximize，可得到最优方案为：超声时间为30 min、超声功率为57.59 W、乙醇体积分数为 52.03%、料液比 1:23.85，黄金茶中总黄酮得率预测值为19.01%。考虑实际操作过程的方便性，选择提取工艺参数为：超声时间为30 min，超声功率为58 W、乙醇体积分数为52%、料液比1:24，在该工艺下进行三次平行实验所得的总黄酮平均得率为 19.38%±0.12%，与预测值之间的相对误差仅为1.9%，变异系数仅为0.6%，重复性非常好。该模型能较好的预测黄金茶总黄酮的得率。与耿敬章等[30]采用超声协同复合酶提取山腊梅中的黄酮相比，该试验中黄金茶总黄酮得率略高。究其原因，一方面是原料产地和品种不同，耿所用的山腊梅叶采自陕南植物园，文献中[1]未见其在陕西广泛分布；本文中所用材料购自浙江丽水，山腊梅在浙江境内分布较广，可见山腊梅更喜浙江气候和水土条件。另一方面山腊梅中的黄酮含量与其采摘月份有关，从5月到10月，黄酮类总含量呈现逐步递增趋势[31]。

2.5 纯化后总黄酮对胰蛋白酶活性的测定结果

经聚酰胺树脂纯化，30%的乙醇洗脱的总黄酮对胰蛋白酶的抑制活性随着黄酮浓度的增加而增加，但是当黄酮浓度达到一定值后，其对胰蛋白酶的抑制率急剧下降（图8）。

图8 纯化后黄酮对胰蛋白酶活性的影响Fig.8 The effect of the purified flavonoids on the activity of trypsin

纯化后黄酮中可能含有芦丁、槲皮素、山奈酚和木犀草素等[4,32]成分，许明等[15]发现异槲皮素、芦丁对胰蛋白酶无明显的抑制作用，而槲皮素对胰蛋白酶有较强的抑制作用，对胰蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)为0.115 mol/L，最大抑制率为80%，对胰蛋白酶的抑制类型为非竞争与反竞争混合型。纯化后黄金茶中的总黄酮对胰蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)为 1.04 mg/mL，当样品浓度为 1.36 mg/mL，抑制率达到57.14%，随后抑制率随样品浓度的增加而下降。这可能与黄金茶黄酮中各成分与胰蛋白酶的作用机制、作用位点以及抑制类型有关；并且样品溶液是混合物，在抑制胰蛋白酶活性时各成分可能存在协同或者拮抗的作用。赵红辉等[33]证明当类黄酮浓度为0.8 µmol时，槲皮素对胰蛋白酶活性的抑制率达到最大，为46%左右。类黄酮对胰蛋白酶活性的抑制率大小为槲皮素>木犀草素>山奈酚>芦丁>芹菜素。笔者猜测总黄酮中对胰蛋白酶发挥主要抑制作用可能是槲皮素及其衍生物。

胰蛋白酶抑制剂主要来自动、植物和微生物中，目前研究比较多的是大豆中的胰蛋白酶抑制剂，程芬芬等[34]采用硫酸钠盐析法从大豆乳清废水中选择性回收大豆胰蛋白酶抑制剂，且以商品化的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂为对照表征 STI的理化性质和界面性质。在临床上，胰蛋白酶抑制剂用于保护胰脏、防止凝血异常、抑制脑血管通透性增高、治疗脑水肿、抑制和治疗癌症，在农业防虫害方面也得到了应用[15]。分析黄金茶黄酮对胰蛋白酶的抑制能力，为其在食品、医药保健行业中更合理有效的利用提供依据。

3 结论

通过超声波辅助乙醇溶剂提取黄金茶中的黄酮，用分光光度法测定总黄酮的含量，对超声时间、超声功率、乙醇体积分数、料液比各因素进行单因素分析及响应面优化提取工艺，得出最优条件为超声时间为30 min，超声功率为58 W、乙醇体积分数为52%、料液比 1:24，测得黄金茶总黄酮在此条件下的得率为19.38%±0.12%，实验结果与预测结果较为吻合。该研究为黄金茶黄酮的提取工艺提供了理论依据，为提高黄金茶的综合利用奠定了理论基础。30%的乙醇洗脱的总黄酮对胰蛋白酶具有明显的抑制作用，对胰蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)为1.04 mg/mL，当样品浓度为1.36 mg/mL，抑制率达到57.14%。鉴于黄金茶黄酮类化合物具有多种功能活性以及对胰蛋白酶的抑制性，可应用到保健食品、医药领域，为扩大黄金茶的开发利用提供基础依据。

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