不同品系红松籽油脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

张思桐，杨凯，赵玉红

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）（2.黑龙江省林业科学研究院，黑龙江哈尔滨 150081）

红松(Pinus koraiensis)，又称海松、红果松，为松科松属植物的常绿乔木。在中国主要分布在东北长白山到小兴安岭地区，常与鱼鳞松、红皮云杉等组成混交林，是重要的农林资源[1]。红松籽是松子成熟种子去皮后得到的种仁[2]，红松籽颗粒饱满，营养丰富，粗蛋白约16.5%、粗脂肪约63.5%、水分含量约4.2%、纤维含量13.6%、灰分3%左右[3]。松籽油含有的总酚与VE使其具有较强的抗氧化能力，此外还含有角鲨烯、芝麻素、谷甾醇和虾青素等甾醇类物质，具有优良的营养价值[4,5]。研究表明，松籽油有调节血脂代谢[6]，有抑制食欲、近一步达到减肥的效果[7]，并具有抗癌[8]等功效。

松籽仁的高需求使得世界产量逐增。中国、韩国、俄罗斯和巴基斯坦都成为红松的主要出口国[9]。松籽油出油率因提取方式的不同而略有差异(例如：冷压榨法或溶剂浸提法)，但多数研究报道都在45～65 g/100 g左右[10～12]。Ryan等[12]研究表明松籽油中脂肪酸通常为50%多不饱和脂肪酸(PUFAs)、40%单不饱和脂肪酸(MUFAs)和 10%饱和脂肪酸(SFAs)。其中主要的多不饱和脂肪酸为亚油酸(48.4%)、油酸(25.5%)及棕榈酸(4.2%)[12,13]。此外，西伯利亚红松和某不确定基因型的红松松籽油的过氧化值范围在0.26～1.00 meq O2/kg和0.22 meq O2/kg[11,12]，这些结果均表明了松籽油中的不饱和脂肪酸具有良好的抗氧化稳定性，松籽油中存在植物甾醇、生育酚和鲨烯等。

国内外对红松籽油的研究多为提取工艺[14]、开发调和油、软胶囊和化妆品等衍生产品[15～17]、降血脂等动物实验研究[18]及脂肪酸成分研究[19]等。而对高寒地区生长的不同品种(品系)红松籽油成分及抗氧化的对比研究甚少。本研究选取黑龙江地区抗寒、丰产的10种红松为原料，进行提取油脂，研究10种松籽油脂肪酸组成、理化性质及抗氧化活性，通过主成分分析和聚类分析筛选出优势红松品系，为今后红松品种选育、食用松籽的生产提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 实验材料

依据黑龙江省林业科学研究所在省内主要地区进行的抗寒性、丰产性评价基础，在 25个品系中选取10个品种（品系）的红松材料编号为1#025、2#058、3#060、4#066、5#117、6#118、7#119、8#124、9#148、10#179；-20 ℃冷藏。

1.1.2 实验药品

三吡啶基三嗪，上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯等。

1.1.3 主要仪器与设备

DZF-6053型烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；中药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；JA2003型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；索氏抽提器，上海精科精密仪器公司；RE-2000A旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；Agilent GC 6890-MS 5973N型GC/MS气质联用仪，济南捷岛分析仪器有限公司；722N可见分光光度计，上海市佑科仪器仪表有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TDL-40B-W离心机，上海习仁科学仪器有限公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

将10种的红松籽去壳、去皮，粉碎烘干于-20 ℃保存。出油量的测定参照GB/T 5512-2008《食品中粗脂肪的测定》的方法[20,21]。采用索氏提取法提取率最高[22]，溶剂选用石油醚，抽提时间为 6 h。红松籽出油率为：

式中：W为出油率%；M为试样质量，g；M1为空烧瓶质量，g；M2为烧瓶与油样质量，g。

1.2.2 脂肪酸分析

采用气相色谱法，脂肪酸经甲酯化：称取油脂 3 mL，置于10 mL容量瓶内，加入1 mL正己烷和苯的混合溶剂(体积比1：1)，轻轻摇匀使之溶解；再加入1 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，混匀；在室温条件下静置30 min，加1 mL蒸馏水使全部有机相甲醇溶液升至瓶颈上部；静置，取上清液，用于GC气象色谱分析。

气相色谱条件[19]，色谱柱：SP-2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm，Supelco，PA)；色谱条件：进样口温度250 ℃，载气 N2，流速 52 mL/min；柱温先保持 100 ℃(5 min)，采用程序升温以4 ℃/min升至220 ℃保持20 min，并计算出不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸含量及其比值。

1.2.3 VE测定

参照邓娜等[23]方法。VE含量计算式为：

式中：X为样品中维生素E的量，µg/g；c为标准曲线上查得样品溶液中维生素E的含量，µg/mL；c0为标准曲线上查得样品空白液中维生素E的含量，µg/mL；m为样品质量，g；V为样品提取后加入无水乙醇定容之体积，mL。

1.2.4 抗氧化测定

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性

参考 Emira Noumi等[24]方法，采用1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH测定DPPH自由基清除能力。经调整，取0.1 mL红松籽油定容到2 mL混匀，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混匀，于暗处避光处理30 min，在波长517 nm处测定其吸光度。

式中：A1为样品与DPPH反应的吸光度；A2为DPPH替换成无水乙醇的吸光度；A3为空白组的吸光度。

1.2.4.2 总还原能力

采用FRAP法，参考E.Tsantili等[25]方法，精确称取6.08 mg硫酸亚铁标准品溶解于50 mL蒸馏水中，即得浓度为0.1 mol/L的硫酸亚铁标准溶液。分别稀释为0.01，0.02，0.04，0.05，0.08，0.1 mol/L浓度。加入配好的3 mL FRAP工作液（现配37 ℃保温）混匀，于37 ℃水浴中反应30 min，在波长593 nm处测定其吸光度。绘制标准曲线，得到的回归方程为：y=3.9242x-0.0006，相关系数R2=0.9999。

样品FRAP测定：取样液100 μL，按上述步骤操作，在波长593 nm处测定其吸光度。样液中抗氧化能力以FRAP值表示，即样品的抗氧化能力相当于硫酸亚铁标准品的mmol/L数。

1.2.4.3 羟基自由基清除能力

参考孟阿会[26]方法。加1 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L硫酸亚铁溶液进试管；后分别加1 mL的稀释样液；最后加入1 mL 0.1%双氧水溶液摇匀，放置在37 ℃反应30 min，反应结束后在4000 r/min 30 min离心，取上清液测其在510 nm处的吸光值。以蒸馏水取代双氧水作为对照组，以蒸馏水取代样液作为空白组。

式中：A1为样品的吸光度；A2为对照组的吸光度；A0为空白的吸光度。

1.2.4.4 超氧阴离子清除能力

参考周凤娟等[27]实验方法，以维生素C为对照品，采用邻苯三酚自氧化法测定核桃油自由基清除剂对其产生的超氧阴离子自由基的清除作用。分别取 1.0 mg/mL油-乙醇溶液、维C溶液于10 mL试管中；加入pH 8.2的Tris-HCl溶液，20 ℃水浴20 min平衡；加入5 mL邻苯三酚溶液50 μL迅速混匀。以蒸馏水为空白，每30 s一个周期测定溶液在325 nm处的吸光值。

式中：A1为样品的吸光度30 s内变化值；A0为空白的吸光度30 s内变化值。

1.2.5 理化性质

参照国标 GB/T 5530-2005、GB/T 5532-2008和GB/T 5538-2005测定油脂酸价[28]、碘值[29]和过氧化值[30]。

1.2.6 统计分析

用Origin 8及SPSS 21.0对数据进行分析，所得结果用平均值±标准差(±s，n=3)表示，以 p＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与讨论

2.1 不同品系红松松籽油脂出油率

10种红松松籽不同部位的出油率见表1。由表可知，10种松籽仁平均出油率为 64.74%，出油率从61.33%（4#060）到69.05%（4#066）不等，其中有4个品种的出油率大于 65%(1#025、4#066、5#117、9#148)。10个品种中，1#、4#、9#与其余红松籽仁的出油率间存在显著性差异(p＜0.05)。与伊春市林业局红松籽[14]含油量（68.06±0.23）%相符，略低于 H.Miraliakbari等[31]研究加拿大松仁油出油率(75.1±0.2)%。

经三者比较，东北红松与加拿大红松含油量存在明显差异且含油量也会受不同地域及气候等环境因素而影响。此外，松籽壳和松仁红衣的平均出油率为9.27%、20.94%，最高值仅 30%左右，是松籽仁含油量的一半以下。因此，红松松籽油出油率高，具有较高的商业价值。

表1 不同品系红松籽出油率Table 1 The oil yield of Pinus koraiensis seed from different strains

2.2 松籽油理化性质

由表2可见，不同品种松籽油之间理化性质存在显著差异（p＜0.05）。酸价是用于评定油脂好坏，酸价越小，油脂新鲜度越好。松籽油脂的酸价在0.72～1.12 mg KOH/g之间，即6#118酸价最小，油脂质量最好，5#117最次。

而碘值则反应油脂的不饱和程度和干性，碘值越大则不饱和程度越大，油干性越大。碘值在88.13～127.22 g I2/100 g之间，其中8#124碘值接近130 g I2/100 g干性油。过氧化值用于衡量油脂酸败程度，过氧化值越高，酸败越严重。其过氧化值在0.17～1.28 meq/kg之间。国家食品卫生标准GB 2716-2005对油脂酸价和过氧化值有一个统一的最高限量标准，即植物原油酸价≤4 mg KOH/g，过氧化值≤19.7 meq/kg，实验结果均在国标范围以内。

表2 不同品系红松籽油脂理化性质比较Table 2 Comparison of physicochemical properties of Pinus koraiensis seedoil from different strains

表3 不同品种松籽油脂脂肪酸分析Table 3 Fatty acid analysis of different Pinus koraiensis seed oil

2.3 不同品系松籽油脂肪酸组成及含量

2.3.1 脂肪酸组成及含量

通过气相色谱法对不同种类松籽油的脂肪酸进行分析，分析谱图见图1，分析结果见表3。

由表3可知，不同品种松籽油脂肪酸含量略有差异。10种红松松籽油脂肪酸均以亚油酸含量最高，平均 含 量 为 44.84%， 从 43.203%(10#179)到46.135%(6#118)不等。

图1 松籽油脂肪酸成分气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of fatty acid in different Pinus koraiensis seed oil

与朱雪梅等[19]研究松籽油脂肪酸分布特征中亚油酸含量46.29%相符。而榛子类坚果则以油酸含量最高，均含量70%左右[23]。亚油酸作为人体必需脂肪酸，具有降低血脂、抗癌等功能[32,33]。松籽油富含的多种不饱和脂肪酸，使其在降血压、降胆固醇等方面具有重要作用，故而松籽油具有很高的营养价值。脂肪酸中油酸含量均在亚油酸含量的一半以上，平均含量为26.57%，与亚油酸呈负相关，二者总含量超过70%。其中饱和脂肪酸棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)均含量分别为 5.18%和 2.53%。十六碳烯酸(C16：1)和二十碳酸(C20：0)含量较少，从 0.59%（8#124）到 0.733%(4#066)、0.49%(4#066)到 0.754(1#025)不等。UFA/SFA、MUFA/SFA、PUFA/SFA的均值分别为10.67、3.45和7.22，多不饱和脂肪酸占有的比例最大，为单不饱和脂肪酸的2.1倍。

因高不饱和脂肪酸含量(90%)极易影响油脂氧化稳定性，根据脂肪酸氧化速率油酸：亚油酸：亚麻酸=1：10：20，亚油酸高于橄榄油(9.48%亚油酸)五倍更易氧化[34]。所以松籽油中天然的抗氧化物质对抑制氧化、延长货架期具有重要作用。

2.3.2 VE分析

比色法测定 VE含量。标准曲线为y=0.22882x+0.01624，R2=0.99907，回归曲线在0～4.0 μg/mL范围内线性良好。

由表4可知，不同品种松籽油间的α-VE含量存在显著性差异(p＜0.05)。10种松籽油 α-VE含量在23.07±1.94 μg/g～162.22±6.55 μg/g，平均值为 97.33 μg/g。其中α-VE含量＞100 μg/g的有6种(3#、6#、7#、8#、9#和 10#)。品种 1#、2#、4#、5#与 Margit Kornsteiner等[35]对松籽油的α-VE含量研究值2.20 mg/100 g～6.00 mg/100 g一致，品种3#、6#、7#、8#、9#、10#与朱雪梅等[19]α-VE 含量15.01±1.22 mg/100 g 相符。SI值用于衡量油脂氧化稳定性，可知氧化稳定性顺序为5#＜2#＜4#＜1#＜3#＜7#＜6#＜10#＜8#＜9#，即 9#148 和8#124油脂氧化稳定性最好，可以储存的时间较长。结合2.3.1结果可知，油脂氧化稳定性与油脂中脂肪酸含量关系不明显，而与存在的抗氧化物质有关。

表4 不同品种松籽油的VE分析Table 4 VE analysis of different Pinus koraiensis seed oil

2.4 不同松籽油抗氧化能力比较

图2 不同松籽油抗氧化能力Fig.2 The antioxidant activities in different Pinus koraiensis seed oil

10种松籽油的抗氧化能力(DPPH、超氧阴离子、羟基自由基、FRAP总还原能力)见图2。其中10种松籽油整体的羟基自由基和超氧阴离子的清除能力较强，且2#058、3#060、4#066、5#117超氧阴离子%＜羟基自由基%，平均清除率为82.71%和70.46%。DPPH清除率均在60%以下，不同品种之间差异甚微。与其他三个抗氧化指标相比，FRAP总还原能力则因松籽油品种不同而存在显著差异(p＜0.05)，可用于区分 10种松籽油的指标。2#058、3#060、9#148和10#179的总还原能力远高于 5#117、6#118、7#119和8#124。3#060、9#148和10#179整体抗氧化能力最好，与表4中α-VE含量较多的3#、6#、9#、和10#相符，即松籽油抗氧化能力与VE含量及其他天然抗氧化物质相关。

2.5 脂肪酸含量与抗氧化活性的相关性

不同品种松籽油的脂肪酸含量与抗氧化活性存在复杂的正负相关性。由表 5 可知，C18：2与 C18：3、C18：0与 SFA、C18：1与 MUFA、C18：2与 MUFA、C18：2与 PUFA、C18：3与 PUFA、SI与 VE均存在极显著正相关。C18：1与 C18：2、C18：1与 C18：3、C18：3与 MUFA、C18：0与 UFA/SFA存在极显著负相关（p＜0.01）。

C16：0与 C18：0、 C18：0与 MUFA/SFA 、 C18：0与PUFA/SFA 存在负相关。C18：1与 MUFA/SFA、UFA/SFA与MUFA/SFA、SI与OH存在正相关(p＜0.05)。除此，OH 与 C18：0、C18：1、SFA、FRAP、VE 和 SI存在较弱的正相关；与C18：3、PUFA、UFA/SFA、PUFA/SFA存在较弱的负相关。FRAP与C16：0存在较弱的正相关。VE、SI与 C18：3存在较弱的负相关。不同松籽油油脂的氧化稳定性可以由OH、FRAP、SI衡量，即OH、FRAP值越大，VE含量最多，SI稳定系数越大，则PUFA、UFA/SFA、PUFA/SFA越小。

表5 松籽油相关性分析Table 5 Correlation analysis among different Pinus koraiensis seed oil

注：*p＜0.05（双侧），**p＜0.01（双侧）。

2.6 聚类主成分分析(CLU-PCA)

公因子方差中各个变量共同度较高（均大于0.77），表明变量中大部分信息能被因子所提取，说明因子分析结果有效，可进行主成分分析。碎石图用来确定最优的主成分数目，横坐标代表主成分数目，纵坐标代表特征值。

图3 碎石图Fig.3 Screen plot of PCA (principal component analysis)

图4 主成分散点图Fig.4 Scatter diagram of PCA(principal component analysis)

图5 聚类分析Fig.5 Cluster analysis

主成分特征值的连线陡峭部分即为应取的主成分数目。由碎石图和Total Variance Explained分析可知，前3个因子的特征值λ＞1，连线较为陡峭，且累计方差贡献率占86.39%，即前3个主成分对解释变量的贡献最大。

变量在主成分中得分的绝对值越大就表明其特征性越显著。主成分的载荷矩阵旋转之后载荷系数更接近1或者更接近0，这样得到的主成分能够更好的解释和命名变量。由图和表可知，前3个主成分累计得分为86.39%(＞80%)，代表10种松籽油脂肪酸86.39%的信息。其中，第一主成分F1贡献率最高为41.905%，在变量 C18：1、C18：2、C18：3、MUFA、PUFA 具有较高的载荷系数。

其中 C18：2、C18：3、PUFA 在 F1上呈负向分布，C18：1和MUFA呈正向分布，即在F1坐标正向越大，C18：1、PUFA 最大，C18：2、C18：3、PUFA 越小，则 F1代表不饱和脂肪酸因子；F2贡献率为30.76%，变量C18：0、SFA呈负相分布，UFA/SFA、MUFA/SFA和PUFA/SFA呈正向分布，则F2代表碳18饱和脂肪酸因子；F3贡献率为13.724%，变量VE、SI和OH呈正向分布，则F3代表抗氧化稳定性因子。

在SPSS 21.0中根据10种松籽油中脂肪酸的含量、主成分的特征值和载荷值绘制出其主成分散点图[36]。以F1为横坐标，F2、F3主成分值为纵坐标。根据散点图中点与点之间的距离代表特征差异程度。

用主成分F1、F2、F3作为变量通过聚类分析得到3类：一类是1#025、2#058、4#066和5#117（抗氧化活性弱于二、三类）；二类是6#118、7#119、8#124、10#179；三类是3#060、9#148。同一类群松籽油的脂肪酸组成、含油量以及抗氧化活性具有相似性。

表6 各主成分的特征值和方差贡献率Table 6 The characteristic value and variance contribution rate of each principal component

表7 主成分分析旋转矩阵Table 7 Rotated component matrix of PCA (principal component analysis)

3 结论

10种松籽油均具有较高的出油率和抗氧化活性，且松籽油中富含丰富的亚油酸等不饱和脂肪酸。通过对10种松籽油的脂肪酸和抗氧化稳定性研究可知：同一类群松籽油的脂肪酸组成、含油量以及抗氧化活性具有相似性。依据主成分分析和聚类分析将10种松籽油分成 3个类群：一类是 1#025、2#058、4#066和5#117；二类是6#118、7#119、8#124、10#179；三类是3#060、9#148。

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