HS-SPME-GC-MS分析高产酯低产高级醇酿酒酵母发酵酒的风味物质

李维，崔丹瑶，王建辉，张翠英，肖冬光

（天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种单细胞真核生物，是人类接触和应用最早的微生物，在食品、医药和饲料等领域被广泛应用[1]。在酿酒工业的发酵过程中，酿酒酵母将进入细胞的葡萄糖等单糖在酶的作用下，转化为酒精和二氧化碳等成分[2]。酿酒工业是全球很多国家和地区的传统优势产业，在经济发展中扮演着重要的角色。我国是最早拥有酿造制酒技术的国家之一，至今已有数千年。白酒是我国特有的蒸馏酒，在酿造过程中，以酵母菌、霉菌等自然微生物制作酒曲（大曲、小曲和米曲等）作为发酵剂是我国酿酒技术领域的重大发明之一[3]。

白酒的主要成分是水和乙醇，由酒曲微生物代谢、原料分解及化学反应生成的风味物质虽然占比只有1%～2%，但决定着酒的品质和风格。目前白酒可检测到的微量成分有300多种，除极少量的无机化合物之外，均是具有挥发性的有机化合物[4,5]。根据化学属性，白酒中的风味物质可分为酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、内酯类、吡嗪类、芳香族和呋喃类等[6]。这些化合物所具有的特定的呈香呈味基团，互相补充、配合、衬托、制约，构成了不同香型和风格白酒的典型特征[7]。风味物质中，高级醇主要由酿酒酵母在酿造的主发酵时间段生成[8,9]。适量的高级醇可以赋予酒特殊的香气，使口感丰满柔和，圆润醇厚，给人愉快舒适的感觉[10]；若浓度过高，则有令人不快的杂异味，并且饮用后容易“上头”，危害人体健康[11]。酯类物质来自酵母的生物合成、酒曲中酯化酶的催化合成以及贮藏陈酿过程中的酯化反应[12～14]。酯普遍具有果香味，且阈值较低，对各种酒类风味典型性的形成有着关键的作用[15]。如何将酒中高级醇的含量控制在合适的范围内，将酯的含量在合适的范围内提高，是酿酒行业一直关注的课题[14,16]。

本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测由不同的高产酯低产高级醇酿酒酵母参与发酵的酒中的风味成分，比较它们对酒风味形成的差异，并采用气相色谱对其中主要的风味物质进行定量分析，旨在研究这几株酿酒酵母对酒中高级醇和酯含量的影响，为其实际应用奠定坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株：酿酒酵母工业菌株AY15（CICC32315）、低产高级醇酿酒酵母菌株AY15-BAT2[17]、高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株 AY15-BAT2+ATF1[17]和AY15-IAH1+ATF1[17]，均由天津科技大学天津市工业微生物重点实验室保藏。

材料：浓香大曲、高粱粉，某浓香型白酒厂提供；玉米粉，市售；液化酶、糖化酶，来自诺维信(中国)生物技术有限公司。

试剂：乙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸、丁酸、己酸（均为色谱纯），来自天津光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、7890A气相色谱仪、G4512A自动进样器，来自美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、固相微萃取（SPME）手柄，来自美国Supelco公司；IT-09A恒温磁力加热搅拌器，来自上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 白酒发酵

将高粱粉碎，60%以上通过20目筛孔；500 mL三角瓶称取高粱80 g，加入到200 mL 60 ℃水中，加入液化酶 20 μL，加热至 85～90 ℃，维持 1 h；115 ℃灭菌30 min，冷却至60 ℃，加入糖化酶40 μL，维持30 min；冷却至40 ℃，加酸性蛋白酶，维持30 min；冷却至30 ℃，加入大曲20 g，加脂肪酶0.08 g，接酵母（细胞数500万/mL），总体积补充至300 mL，搅拌均匀；30 ℃静置发酵，48 h添加己酸（500 mg/L）；发酵5 d，将三瓶发酵醪合并蒸馏，蒸馏至酒度为50%(V/V)。

1.3.2 萃取[18]

将酒样稀释至12% (V/V)，取8 mL置于20 mL螺口顶空样品瓶，加3 g氯化钠，放入磁性转子，用聚四氟乙烯将瓶口紧密封好。样品在恒温磁力搅拌器中60 ℃平衡 10 min，将萃取头插入瓶内顶空吸附 40 min。萃取后将萃取头插入GC-MS系统进样口，250 ℃解吸附5 min。

1.3.3 GC-MS条件[18]

气相色谱条件：色谱柱为 Agilent CP-Wax（60 m×0.25 mm×0.5 μm）；进样口温度为250 ℃，不分流；载气氦气流速为0.8 mL/min；升温程序为起始40 ℃维持2 min，按照2 ℃/min的速度升到100 ℃，再按照4 ℃/min的速度升到230 ℃，维持3 min。

质谱条件：EI；70 eV；扫描范围30～500 u；离子源温度230 ℃。

1.3.4 GC条件[17]

检测条件：检测器为 FID，色谱柱为 Agilent 1909N-213（30 m×320 μm×0.5 μm），高纯度氮气载气流速设置为2 mL/min，进样口温度为200 ℃，检测器温度为200 ℃，进样量为1 μL，分流比为10：1。起始色谱柱温度为50 ℃并维持8 min，然后按照5 ℃/min的速度提升到120 ℃，维持5 min。

1.4 数据处理

定性：GC-MS的结果经NIST08谱库进行定性分析，对样品中各挥发性成分的相对含量进行计算，利用面积归一法。

定量：以乙酸正戊酯作为内标，对样品中含量较多的风味物质进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 不同高产酯低产高级醇酿酒酵母挥发性风味物质的鉴定及分析

在 AY15、AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1参与发酵的酒样中分别鉴定出62、56、63、59种挥发性成分，结果如表1。

图1 AY15酒样挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 TIC of volatile components in liquor sample by AY15

图2 AY15-BAT2酒样挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.2 TIC of volatile components in liquor sample by AY15-BAT2

图3 AY15-BAT2+ATF1酒样挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.3 TIC of volatile components in liquor sample by AY15-BAT2+ATF1

图4 AY15-IAH1+ATF1酒样挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.4 TIC of volatile components in liquor sample by AY15-IAH1+ATF1

在白酒发酵过程中，分别添加酿酒酵母野生菌株AY15和拥有不同高级醇和酯生成能力的酿酒酵母菌株 AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1，对其发酵后蒸馏得到的酒样进行HS-SPME-GC-MS检测分析，总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）见图1、2、3和4。

有AY15参与发酵的酒样主要挥发性成分有42种酯类、除乙醇外6种醇类、2种醛类、3种酸类、5种烷烃、1种芳香烃、1种酚类和1种萜类。其中，酯醇酸醛四大类物质的含量分别占总挥发性成分的60.90%、6.32%、0.08%和2.62%，其它物质的含量占挥发性成分的0.60%。有AY15-BAT2参与发酵的酒样主要挥发性成分有36种酯类、除乙醇外7种醇类、1种醛类、3种酸类、5种烷烃、1种酮类、1种酚类、1种萜类。其中，酯醇酸醛四大类物质的含量分别占总挥发性成分的54.35%、4.62%、0.04%和2.14%，醇类物质的相对含量相比AY15降低了26.93%；其它物质的含量占挥发性成分的0.65%。

有 AY15-BAT2+ATF1参与发酵的酒样主要挥发性成分有44种酯类、除乙醇外5种醇类、1种醛类、3种酸类、5种烷烃、1种芳香烃、1种酮类、1种酚类、1种萜类。其中，酯醇酸醛四大类物质的含量分别占总挥发性成分的67.15%、4.28%、0.03%和2.19%，酯类物质的相对含量相比AY15提高了10.27%，醇类物质的相对含量相比AY15降低了32.30%；其它物质的含量占挥发性成分的 0.45%。与 AY15相比，AY15-BAT2+ATF1样品中新检出乙酸正丁酯、乙酸庚酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸-甲氧基-2-苯乙酯五种乙酸酯。有AY15-IAH1+ATF1参与发酵的酒样主要挥发性成分有42种酯类、除乙醇外6种醇类、1种醛类、3种酸类、3种烷烃、1种芳香烃、1种酚类、1种萜类。其中，酯醇酸醛四大类物质的含量分别占总挥发性成分的68.21%、4.50%、0.04%和1.90%，酯类物质的相对含量相比AY15提高了12.01%，醇类物质的相对含量相比AY15降低了28.73%；其它物质的含量占挥发性成分的 0.35%。与 AY15相比，AY15-IAH1+ATF1样品中新检出乙酸正丁酯、乙酸辛酯两种乙酸酯。

表1 挥发性成分在不同酿酒酵母菌株酒样中的相对含量Table 1 Relative contents of volatile components in liquor samples by different yeast strains

3 1 4 7.2 3 己酸己酯 0.6 3 0.8 4 0.4 1 0.6 2 3 2 4 8.8 5 辛酸3-甲基丁酯 - 0.2 9 0.1 3 0.2 0 3 3 4 9.1 7 反式-4-癸烯酸乙酯 0.0 4 0.2 9 0.0 3 0.0 4 3 4 4 9.5 8 丁二酸二乙酯 0.5 5 0.3 9 0.4 8 0.3 3 3 5 4 9.7 2 苯甲酸乙酯 0.0 8 0.0 8 0.0 6 0.0 6 3 6 4 9.9 4 9-癸烯酸乙酯 0.1 2 - 0.0 7 -3 7 5 0.9 0 癸酸正丙酯 - - - 0.0 2 3 8 5 1.3 1 4,8,1 2-三甲基-癸酸乙酯 0.0 5 0.0 7 - 0.0 4 3 9 5 1.4 3 十一酸乙酯 0.1 7 0.1 4 0.0 9 0.1 2 4 0 5 3.2 8 苯乙酸乙酯 0.1 3 0.1 5 0.1 0 0.0 8 4 1 5 4.2 1 乙酸苯乙酯 - - 0.2 1 -4 2 5 4.5 2 月桂酸乙酯 - - 2.7 1 2.9 8 4 3 5 6.1 8 3-苯丙酸乙酯 1.6 6 1.6 7 1.3 3 1.1 3 4 4 5 7.2 1 十三酸乙酯 0.0 6 0.0 7 0.0 3 0.0 3 4 5 5 8.1 7 油酸乙酯 0.5 0 0.4 9 0.2 4 0.6 1 4 6 5 9.8 7 十四酸乙酯 1.6 7 1.4 5 1.2 2 1.0 2 4 7 6 0.9 6 己酸苯乙酯 - - - 0.0 1 4 8 6 1.2 9 亚油酸乙酯 0.4 2 0.5 5 0.2 7 0.4 7 4 9 6 1.4 9 辛二酸二乙酯 0.0 7 - - -5 0 6 2.3 3 1 3-甲基十四酸乙酯 - 0.0 7 - 0.1 1 5 1 6 2.3 4 十五酸乙酯 0.2 3 0.2 1 0.1 2 -5 2 6 3.3 5 乙酸-甲氧基-2-苯乙酯 - - 0.2 8 -5 3 6 3.3 6 己酸-2-苯乙酯 0.6 1 0.7 8 - 0.5 1 5 4 6 4.7 7 棕榈酸乙酯 4.7 0 3.7 1 2.8 1 2.1 1 5 5 6 5.2 6 9-十六碳烯酸乙酯 0.3 4 0.4 1 0.2 4 0.1 8 5 6 6 5.2 7 E-1 1-十六碳烯酸乙酯 0.1 7 - - -5 7 6 6.4 5 9,1 2-十六碳二烯酸乙酯 0.1 0 0.0 9 0.0 2 -5 8 6 7.2 1 1 4-甲基十六酸乙酯 0.0 1 0.0 1 - -醇类5 9 1 1.6 7 乙醇 1 3.1 2 1 2.0 3 1 3.2 5 1 3.3 6 6 0 1 6.8 0 正丙醇 0.0 8 0.0 6 - -6 1 1 9.9 7 异丁醇 1.1 0 0.5 9 0.5 2 0.6 0 6 2 2 3.1 2 正丁醇 0.0 4 0.0 3 - 0.0 4 6 3 2 7.3 4 异戊醇 4.4 6 3.3 2 3.2 2 3.3 4 6 4 3 6.3 4 正己醇 0.4 2 0.3 3 0.3 5 0.3 0 6 5 4 8.0 2 三十烷醇 - - 0.0 1 -6 6 5 2.1 4 油醇 - - - 0.0 5 6 7 5 7.0 4 苯乙醇 0.2 1 0.2 3 0.1 8 0.1 8 6 8 5 7.8 1 十二硫醇 - 0.0 5 - -醛类6 9 4 2.2 0 糠醛 0.0 2 - - -7 0 4 4.7 2 苯甲醛 0.0 5 0.0 4 0.0 3 -7 1 5 1.1 2 E-1 4-十六烷烯醛 - - - 0.0 4

注：“-”表示未检出。

2.2 挥发性风味物质定量分析

对酒样中含量较多的挥发性风味物质进行GC定量分析，结果见表2。

表2 不同酿酒酵母酒样中主要挥发性成分定量分析结果Table 2 Quantitative analysis results of main volatile components in liquor samples by different yeast strains

2.2.1 酯类物质

酯类物质是白酒中含量最多的风味物质之一，是酒中香气的主要来源[15]。有 AY15-BAT2参与发酵酒样的乙酸乙酯与乙酸异戊酯相比 AY15没有显著差异。有AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1参与发酵酒样的乙酸乙酯与乙酸异戊酯则有显著提高，乙酸乙酯生成量分别为1559.43 mg/L和1598.89 mg/L，相比AY15提高90.39%和95.21%；乙酸异戊酯生成量分别为12.96 mg/L和15.40 mg/L，相比AY15提高108.39%和147.55%。其它的主要酯类物质丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯，四株酿酒酵母之间没有明显区别。结果表明高产酯低产高级醇的两株酿酒酵母可以在不影响其它主要酯含量的情况下，显著提高酒中主要乙酸酯的含量；低产高级醇酿酒酵母不影响主要酯类物质的生成。

2.2.2 高级醇

高级醇不仅衬托出酯香，还使口感丰满柔和，圆润醇厚[10]，但若其浓度过高，则有令人不快的杂异味，并且饮用后容易“上头”[11]。有 AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1参与发酵酒样的正丙醇、异丁醇和异戊醇相比AY15均有显著减少且程度各不相同：AY15-BAT2样品中三种高级醇的含量分别降低了 9.2%、44.13%和 18.72%，AY15-BAT2+ATF1样品中三种高级醇的含量分别降低了 14.67%、58.69%和 30.96%，AY15-IAH1+ATF1样品中三种高级醇的含量分别降低了15.06%、32.84%和25.95%。结果表明三种酿酒酵母在白酒发酵过程中具有不同的高级醇生成能力，结合其不同的乙酸酯生成能力，使得最终得到的酒样中的酯与高级醇的比例有不同程度的提高。

2.2.3 酸类物质

酸类物质是形成口感和味道的重要成分，也是形成酯的前体物质，对酒的后味起到平衡和协调的作用[19]。有AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1参与发酵酒样的乙酸、丁酸、己酸相比 AY15均没有显著差异。结果表明三株酿酒酵母菌株在改变酯与高级醇含量比例的情况下，对酸类物质的含量没有明显影响。

3 结论

采用 HS-SPME-GC-MS检测由不同的高产酯低产高级醇酿酒酵母参与发酵白酒中的挥发性成分，发现酯与高级醇的比例相比野生菌株均有不同程度的提高。其中，AY15-BAT2+ATF1样品中新检出乙酸正丁酯、乙酸庚酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸-甲氧基-2-苯乙酯五种乙酸酯，AY15-IAH1+ATF1样品中新检出乙酸正丁酯、乙酸辛酯两种乙酸酯。对酒样中的主要风味物质进行定量分析，两株高产酯低产高级醇酿酒酵母在不影响其它主要酯含量的情况下，显著提高乙酸乙酯和乙酸异戊酯的含量；低产高级醇酿酒酵母则不影响主要酯类物质的生成。三种酿酒酵母不同程度的降低了酒中正丙醇、异丁醇和异戊醇的含量，结合其不同的乙酸酯生成能力，最终不同程度的提高了酯与高级醇的比例。研究结果为这三株高产酯低产高级醇酿酒酵母在工业中的实际应用提供实验依据。

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