直链淀粉-番茄红素复合物的热稳定性及降解动力学变化

孙世东，赵文红

（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450000）

番茄红素（Lycopene）是来源于植物性食物的一种类胡萝卜素，广泛存在于番茄、番石榴和西瓜等植物果实中[1]。它是一种含有多不饱和键的异戊二烯类化合物，这种特殊的结构赋予了番茄红素极强的抗氧化活性[2]。研究表明，番茄红素具有高效猝灭单线态氧[3,4]、抗癌抑癌[5,6]、清除过氧自由基[7]、预防心血管疾病[8,9]、调节细胞间通讯[10]及增强免疫力[11]等多种生理功能。番茄红素因易受光、氧和热等因素的影响而产生降解损失[12-14]，从而极大地限制了其工业化应用。

淀粉为精制谷物的主要成分，其在人体中的消化吸收与健康密切相关[15]。淀粉摄入过多、消化过快会使血糖失衡，不利于人体健康[16]。所以亟需设计和推广能够减缓淀粉消化速率的食物，因此抗性淀粉[17]应运而生。已有文献研究表明[18,19]淀粉-配体复合物的螺旋构象可降低直链淀粉的水解速率，进而能调控糖代谢相关疾病，具有抗消化性。且直链淀粉作为一种良好的壁材，在保护功能性分子方面已得到广泛的应用。Jeong 等[20]研发的白藜芦醇环直链淀粉包合物能够有效保持白藜芦醇的抗氧化活性；周小理等[21]制备的苦荞直链淀粉-黄酮复合物具有抗消化性。

通过制备复合制剂可以增强番茄红素的稳定性。Wang 等[22]制备了番茄红素-β-环糊精包合物，发现在50 ℃下保持210 min，番茄红素的热降解显著高于包合物；刘会晓等[23]制备了番茄红素纳米脂质体，发现无氧避光储藏30 d 后其中番茄红素保留率为80%。此外，还有番茄红素与淀粉类、蛋白类和脂类等结合制成的复合物制剂[24-26]。本课题组为提升番茄红素的储藏和加工稳定性，选用安全可食用的直链淀粉为原料，由于直链淀粉具有特殊的螺旋空腔结构，可通过外力作用（热、溶剂、超高压等处理）使其分子内氢键发生作用，链状结构旋转，形成疏水性左手螺旋空腔[27]，一些配体（如碘[28]、脂质[29]和线性醇[30]等）可以通过此过程与直链淀粉复合并形成复合物。在前期研究中基于直链淀粉的回生特性制备了直链淀粉-番茄红素复合物（Amylose-Lycopene Complexes，ALCs）[31]，并对其结构特性进行表征，但对该复合物的热稳定性尚不明晰。本文即通过环境温度下ALCs 中番茄红素的含量和抗氧化活性变化，分析比较环境温度及时间对其保留率的影响，并进一步研究了了其热降解动力学模型。通过研究ALCs 的热稳定性变化规律，为番茄红素稳定制剂的开发及其加工应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

直链淀粉（土豆来源）、番茄红素标准品，上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜、丙酮、盐酸（质量分数36.5%）、氢氧化钠，均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；氮气（体积分数98%），郑州新丰化学试剂有限公司；蒸馏水和ALCs 实验室自制。

1.2 仪器与设备

UV1800-BPC 型紫外分光光度计，上海美普达仪器设备有限公司；JXDC-10 型氮气吹扫仪，上海净信科技仪器有限公司；YM-120 S 型超声波仪，广东洁盟电器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；MX-S 型涡旋振动器、MS-H280-Pro 型磁力搅拌器，美国SCI LOGEX 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 直链淀粉-番茄红素复合物的制备

参照Lv 等[32]的制备方法，并作修改。称取番茄红素15 mg 溶于15 mL 二甲基亚砜中在50 ℃保温备用；直链淀粉300 mg 用0.4 mL 无水乙醇分散，加30 mL蒸馏水溶解并于95 ℃水浴5 min 后降温至50 ℃；加入番茄红素溶液后以500 r/min 混合搅拌2 h，程序降温至4 ℃后在1 500 r/min 离心30 min，真空干燥沉淀，即得直链淀粉-番茄红素复合物（ALCs）。过程需避光、无氧氮气保护操作。

1.3.2 直链淀粉-番茄红素复合物中番茄红素的含量测定

采用番茄红素标准品，建立其吸收-浓度标准曲线，进行番茄红素含量的计算。分别配置0、2.5、5.0、7.5、10.0 和15.0 μg/mL 的番茄红素丙酮溶液，并用紫外分光光度计测定其在447 nm 处的吸光度，经线性拟合得番茄红素含量标准曲线方程为y=0.156 5x-0.011 3（R²=0.999 9）。称取样品5 mg 溶于10 mL 丙酮中，避光经超声萃取5 min 后以1 500 r/min 离心15 min，取上清液测定其在447 nm 的吸光度，根据标准曲线的回归方程计算其中的番茄红素含量。

1.3.3 直链淀粉-番茄红素复合物的热稳定性

称取一定量复合物样品于若干试管中，分别置于50、70、90、110 和130 ℃下，每隔一定时间取样5 mg。将取出的样品置于试管中加入10 mL 丙酮，用混匀仪处理3 min，避光4 ℃超声处理5 min，1 500 r/min 离心处理15 min，取上清液于比色皿中，使用紫外可见光谱仪测量其在447 nm 的吸光度值。根据吸光度值计算番茄红素含量，绘出各温度下直链淀粉-番茄红素复合物中番茄红素含量及保留率随时间的变化图，并进行降解动力学分析。

式中：

D——番茄红素保留率，%；

C0——ALCs 中番茄红素的初始含量，μg/mL；

Ct——不同时间点测定的ALCs 中番茄红素含量，μg/mL；

V0——ALCs 初始样品萃取番茄红素的丙酮体积，mL；

Vt——不同时间点测定ALCs 中番茄红素时萃取的丙酮体积，mL。

1.3.4 直链淀粉-番茄红素复合物DPPH 自由基清除率测定

抗氧化活性的评价参考Zhou 等[33]的方法，采用DPPH 清除法进行测定。将ALCs 和番茄红素标准品分别置于50、70、90、110 和130 ℃下，每隔一定时间取样5 mg，经10 mL 丙酮超声浸提得到其中的番茄红素；量取1 mL 浸提液加入到3 mL DPPH（0.01 mmol/L）溶液中，避光反应30 min 后在517 nm 处测定吸光度。测定完成后计算复合物的DPPH清除率。计算公式如下：

式中：

E——DPPH 清除率，%；

A0——DPPH 溶液（DPPH 溶液:丙酮=3:1）的吸光度；

A1——无水乙醇与ALCs 丙酮溶液（3:1）的吸光度；

A2——反应后DPPH溶液和ALCs 溶液的混合物的吸光度。

1.3.5 直链淀粉-番茄红素复合物的热降解动力学

参考Aliyu 等[34]的测定方法，并稍作修改。对ALCs中番茄红素的含量变化规律代入零级、一级和二级降解动力学方程式拟合，以探究直链淀粉-番茄红素复合物的热降解动力学特征。各级反应动力学方程式见以下公式（3）、（4）和（5）。

式中：

C0——ALCs 中番茄红素的初始含量，μg/mL；

Ct——不同时间点时番茄红素的相对含量，μg/mL；

T——不同时间点，h；

k——速率常数，μg/(mL·h)。

经降解动力学拟合后根据以上公式计算其速率常数k，μg/(mL·h)、半衰期T1/2，h和十分之一衰期T9/10，h等热降解动力学参数。

1.3.6 数据分析

实验数据使用SPSS 24 进行统计学处理，并采用Origin 2018 和Microsoft Excel 2019 作图。各项指标以均值±标准差表示；实验组与对照组采用配对t检验，定性数据比较采用X2检验。p＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 ALCs 热稳定性研究

为了研究不同温度环境下ALCs 的热稳定性，以番茄红素标准品为对照，研究ALCs 经50、70、90、110和130 ℃处理后其番茄红素含量及其保留率的变化。

2.1.1 复合对ALCs 稳定性的影响

以番茄红素标准品为对照，研究直链淀粉与番茄红素复合对其稳定性的影响。不同温度环境下ALCs和对照品中番茄红素含量变化见图1。

图1 ALCs 和番茄红素标准品在不同温度环境下其番茄红素含量的变化Fig.1 Changes of lycopene content in ALCs and lycopene standard at different temperature

与番茄红素标准品相比，ALCs 在各温度环境处理下有利于其番茄红素稳定性。如图1 所示，在50 ℃处理4 h 时，ALCs 中的番茄红素含量为12.55 μg/mL，显著高于对照组；在70 ℃处理5 h 时复合物和对照品中番茄红素的含量分别为11.39 μg/mL 和10.11 μg/mL；在110 ℃处理6 h时其含量分别为9.43 μg/mL和7.92 μg/mL（p＜0.05）。研究表明：与对照组相比，直链淀粉和番茄红素的复合可对番茄红素起到保护作用，改善长时间热处理对复合物中番茄红素的影响，延缓其中番茄红素的降解损失。这可能是由于复合物为直链淀粉与番茄红素形成的包合型复合物有关。与番茄红素标准品直接暴露在环境中不同，复合物中的番茄红素可进入到直链淀粉的疏水螺旋空腔中，或与直链淀粉分子链缠绕形成稳定的双螺旋结构[35-37]，因此可保护其中的番茄红素免受热降解损失。且同一温度下处理前期降解损失较后期快，是由于空间位阻的存在和番茄红素碳链的长度，使得一部分番茄红素被截留在分子间螺旋结构缝隙中，一部分进入到分子内螺旋腔。番茄红素不能完全进入到直链淀粉的螺旋空腔中，而暴露在环境中的部分番茄红素直接降解，使得前期降解速率较快。孙新虎等[38]制备的番茄红素β-环糊精包合物对番茄红素稳定性起到有效的改善作用。全莉婵等[39]研发了水分散型番茄红素微乳，发现温度与番茄红素稳定性呈负相关。

2.1.2 热处理温度和时间对ALCs 番茄红素稳定性的影响

依照1.3.3 项下公式（1）计算得到ALCs 中番茄红素保留率，研究处理温度和时间对ALCs 番茄红素稳定性的影响见图2。

图2 ALCs 不同处理时间下其番茄红素保留率的变化Fig.2 Changes of lycopene retention rate of ALCs under different treatment times

由图2 可知，各温度环境下，随处理时间延长，ALCs 的番茄红素保留率均呈下降趋势。样品处理3 h后ALCs 中番茄红素保留率分别为87.83%（50 ℃）、86.03%（70 ℃）和75.49%（90 ℃）；继续处理12 h 时，其番茄红素保留率分别显著降低至80.89%（50 ℃）、70.86%（70 ℃）和58.34%（90 ℃）（p＜0.05）。结果表明：复合物的受热时间越长、热处理温度越高，稳定性越低，番茄红素含量损失加剧。朱军敏[40]将番茄红素微囊在40 ℃储存30 d，其番茄红素残存率明显高于在60 ℃下的储存，其研究表明环境温度影响番茄红素制剂的热稳定性。Baenas 等[41]将番茄汁在96 ℃下处理30 s 后番茄红素活性降低了60%，与本研究结果相符。

值得注意的是，在本研究的中高温度（90 ℃和110 ℃）条件下，ALCs 中番茄红素含量呈先升高后降低趋势。其中，在90 ℃处理5 h 时，其中番茄红素含量异常上升至12.79 μg/mL（p＜0.05），继续处理其含量均呈持续下降。Sun 等[42]研究认为顺式构型的番茄红素与反式构型相比，其溶液吸光度升高。因此，高温（90 ℃和110 ℃）处理条件下，番茄红素受热后吸收强度增强的现象可能与其构型转变有关[43]，吸收强度为假性增加。本研究进一步对此样品进行紫外可见光谱全扫描（图3b）可见：与番茄红素对照品（图3a）相比，高温（90 ℃和110 ℃）处理条件下复合物中的番茄红素分别在364 nm 和310 nm 处出现了新的吸收峰。该处为番茄红素顺式峰的吸收位置[12]。结果表明：复合物和标准品中番茄红素在中高温度环境（90 ℃和110 ℃）下会发生构型转变和降解损失。

图3 番茄红素（a）和经中高温（90 ℃和110 ℃）处理的ALCs中番茄红素（b）紫外可见全波长扫描光谱图Fig.3 UV-Vis full wavelength scanning spectra of lycopene (a)and lycopene in ALCs treated with medium and high temperatures (90 ℃ and 110 ℃) (b)

2.2 ALCs 的抗氧化活性变化分析

为了研究热处理对ALCs 抗氧化特性的影响，测定ALCs 在50、70、90、110 和130 ℃条件下的抗氧化活性变化，结果见图4。

由图4 可知，在不同热处理条件下，ALCs 和番茄红素标准品的DPPH自由基清除率整体均呈下降趋势，且表现出比对照组强的抗氧化活性。经过不同热处理，ALCs和对照组番茄红素标准品的DPPH自由基清除率从最初的49.35%（0 h）分别显著降至41.63%和35.57%（50 ℃，12 h）、18.93%和14.42%（70 ℃，12 h）、25.24%和4.81%（90 ℃，10 h）、23.73%和4.06%（110 ℃，10 h）、25.16%和3.55%（130 ℃，6 h）（p＜0.05）。结果表明，在不同热处理条件下ALCs 表现出更强的DPPH 自由基清除能力，即ALCs 能更好地保持番茄红素的抗氧化活性。这可能与储藏过程中复合物对番茄红素的保留有关。柴星星等[44]发现番茄红素纳米分散体的抗氧化活性与其番茄红素含量相关。究其原因，直链淀粉是淀粉分子中的线性组分，具有特殊的螺旋结构，在施加外力（热处理、溶剂处理、超高压等）的作用下，其分子内氢键相互作用、链状结构旋转，形成了疏水性的左手螺旋空腔结构，这时番茄红素便可借助疏水作用力进入直链淀粉螺旋空腔与其复合[45,46]，进而达到对番茄红素有效的保护作用。

图4 不同热处理条件下ALCs 的抗氧化特性Fig.4 Antioxidant properties of ALCs under different heat treatment conditions

在90 ℃和110 ℃条件下，ALCs 的抗氧化活性在处理期间出现了先升高后降低的趋势，这可能是由于番茄红素在高温下构型发生了转变[47]，且顺式构型的番茄红素抗氧化活性更强[48]。但所有热处理条件下ALCs 的抗氧化活性均存在降低现象，这与ALCs 中的番茄红素热降解有关[30]。综上，番茄红素与直链淀粉复合形成ALCs 后，能更好保持其抗氧化活性。

2.3 ALCs 中番茄红素的热降解动力学研究

为了研究不同温度环境条件下ALCs 中番茄红素的热降解变化，参照1.3.5 项下方法进行零级、一级和二级反应动力学方程拟合，并计算其动力学参数。

ALCs 在不同温度环境条件下，其番茄红素的降解动力学拟合反应动力学方程和回归系数R2见表1。比较不同温度下最大拟合R2值可知，在ALCs 中番茄红素在不同温度环境条件下的降解均符合二级反应动力学特征。

表1 不同温度环境条件下ALCs 中番茄红素的降解动力学线性回归方程和系数R2Table 1 Linear regression equations and coefficients R2 for the degradation kinetics of lycopene in ALCs under different environmental conditions of temperature

基于二级反应拟合方程1/Ct-1/C0=kt+b，不同温度环境下ALCs 的降解反应拟合见图5。根据公式分别得出其速率常数k（μg/(mL·h)）、半衰期T1/2（h）和十分之一衰期T9/10（h）等动力学参数见表2。由图可见：不同温度下ALCs 降解动力学常数的排序为k130＞k110＞k90＞k70＞k50，k110值为0.009 2，远大于90 ℃时的0.003 4 及50 ℃时的0.001 1，结果表明随温度升高，ALCs 中番茄红素的降解程度增大，110 ℃以上高温加工环境加剧其中的番茄红素降解变化；由表2 可知，随温度环境升高ALCs 中番茄红素的半衰期呈降低趋势。50 ℃处理条件下ALCs 的番茄红素T9/10为9.58 h，至110 ℃时T9/10缩短至1.15 h。结果表明：随温度升高，ALCs 中番茄红素的热降解反应越快。

图5 不同温度环境下ALCs 的二级降解动力学拟合图Fig.5 Kinetic fitting of secondary degradation of ALCs under different temperature environments

表2 不同热处理条件下ALCs 的热降解动力学参数Table 2 Kinetic parameters of thermal degradation of ALCs under different heat treatment conditions

3 结论

本研究表明制剂ALCs 能改善其中番茄红素的热稳定性。在不同温度处理下，ALCs 中的番茄红素含量均显著高于标准品对照组。处理温度和时间均影响ALCs 中番茄红素的稳定性。不同温度处理后，ALCs中番茄红素的保留率和抗氧化活性均有一定程度的下降。值得注意的，由于顺式构型出现会导致溶液吸光度上升，呈现含量增多的假性现象。本研究中在中高温度下即观察到番茄红素基于构型转变出现的番茄红素含量增加变化，并通过可见吸收分光光谱分析进行了初步验证，但这一方面尚需进一步的结构分析与确证。此外，对 ALCs 中番茄红素热降解行为的研究可见符合二级反应动力学特征。番茄红素降解速率常数k与处理温度t呈正相关，k130＞k110＞k90＞k70＞k50；其衰期T1/2和T9/10均与处理温度t呈负相关，且110 ℃以上高温加工环境加剧其中的番茄红素降解变化，50 ℃时的T9/10为9.58 h 缩短至110 ℃时的1.15 h。结果表明：应用ALCs 制剂进行产品开发时，加工温度过高会造成其热降解反应加快，加剧降解损失。本研究探究不同处理时间和温度对ALCs 中番茄红素热稳定性的影响，为番茄红素的加工应用提供理论依据。