金雀异黄素通过脂联素和RBP4途径调节PCOS-IR大鼠的胰岛素抵抗作用

杨琪，董佳萍，谢琳琳，王鹤霖，刘殊凡，迟晓星,2*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）（2.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319）

多囊卵巢综合征（Polycysticovarysyndrome，PCOS）是一种异质性综合征[1,2]，是生育期女性最常见的内分泌代谢紊乱。胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是指细胞、组织和器官等对胰岛素的敏感性下降，对葡萄糖的吸收代谢能力降低，代偿性的刺激胰岛β细胞分泌更多的胰岛素以维持体内葡萄糖水平，它与心血管疾病、糖尿病和代谢综合征有密切关系。研究发现50%～70%的PCOS患者存在胰岛素抵抗现象，而且其中有40%以上会发展成为葡萄糖耐受紊乱甚至会发展成Ⅱ型糖尿病[3]，但是目前胰岛素抵抗发生的具体过程和确切机制仍不完全清楚。最近发现许多因子如脂联素（Adiponectin，APN）、内脂素等，与PCOS的病理和IR的发生紧密相关，还有一些蛋白质如抵抗素、视黄醇结合蛋白-4（Retinol-Binding Protein 4，RBP4），已经成为评价PCOS-IR的新标记物，但是它们的具体作用机制仍然存在争议，其中APN和RBP4是影响PCOS女性代谢紊乱的最主要因子[4,5]。脂联素在哺乳动物体内是一种来源于脂肪的因子[6]，在体内以多聚体形式存在，包含低、中、高分子量脂联素（HMW）[7]，其可以通过增强棕色脂肪的活性，来改善胰岛素抵抗从而参与调控POCS[8,9]。研究[10]发现，脂联素也可以通过调控糖脂代谢参与代谢过程，发挥有益作用。最近研究[11,12]发现RBP4也是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质，RBP4水平的升高已经被证明与啮齿类动物的肥胖和胰岛素抵抗相关，但是具体的生理功能尚未完全明确。APN与RBP4这两种脂肪细胞因子间存在何种关系，目前研究尚少。

金雀异黄素（Genistein，Gen）是大豆异黄酮的主要活性成分，其分子结构与人体自身雌激素相同。Gen进入身体后，可与雌激素受体结合，进而发挥雌激素的作用，所以Gen被认为是雌激素的天然替代品。相关文献[13,14]报道大豆异黄酮（包括Gen和大豆黄素）可改善高糖血症与高胰岛素血症，具有抗氧化、抗炎、改善血糖血脂等多种生理功能[15,16]。目前，金雀异黄素对多囊卵巢综合征并发胰岛素抵抗大鼠胰岛素抵抗改善作用的报道较少。因此，本实验研究金雀异黄素对脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）和人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）结合高脂饲料诱导建立的PCOS-IR大鼠胰岛素抵抗的改善作用，并研究其具体调节机制，旨在为PCOS-IR的发病机制研究提供新思路，为治疗提供新的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金雀异黄素（纯度99.99%），上海融合有限公司；去氢表雄酮、二甲双胍，上海麦克林生化科技有限公司；注射用大豆油，浙江山雨田有限公司；人绒毛膜促性腺激素，深圳海思安生物技术有限公司；花生油，山东鲁花集团有限公司；HE染液，南京建成生物技术有限公司；胰岛素（Insulin，INS）、APN、含pH域衔接因子蛋白（Adaptor Protein，Phosphotyros Ineinteraction，PH Domain and Leucine Zipper Containing 1，APPL1）、RBP4、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（Phosphoenolpyruvate Carboxykinase，PEPCK）、检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；动物组织总RNA提取试剂盒、反转录试剂、实时定量PCR试剂，碧云天生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；APPL1抗体、RBP4抗体、PEPCK抗体、AMP依赖蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）抗体、磷酸化AMP依赖蛋白激酶（p-AMP-Activated Protein Kinase，p-AMPK）抗体，β-actin抗体，正能生物有限公司。

SPF级22日龄雌性SD大鼠（体质量180～220 g），购买于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。高脂饲料由黑龙江八一农垦大学食品学院自制，质量分数为：78.8%普通饲料、10.0%猪油、10.0%蛋黄粉、0.2%胆酸钠、1.0%胆固醇；配料购自河南万邦化工科技有限公司。本实验遵循黑龙江八一农垦大学动物伦理委员会原则。

1.2 仪器与设备

GA3型血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；酶标仪，中国Mindrary迈瑞医疗公司；实时荧光定量PCR仪、PCR扩增仪、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 造模方法

参考Wang等[17]确立PCOS-IR大鼠模型方法：60只22日龄雌性Sprague Dawley（SD）大鼠按体质量随机分为对照组（10只）和PCOS-IR造模组（50只），造模组大鼠每日皮下注射DHEA 6 mg/100 g（以体质量为基准计）和0.2 mL注射用大豆油，腹部皮下注射1.5 U HCG，每日一次，共42 d。同时，模型组的大鼠喂饲高脂饲料，诱导PCOS-IR模型。对照组大鼠皮下注射相同体积的注射用油、生理盐水和正常饮食。给药并高脂饮食后的第33天开始，大鼠阴道涂片确立PCOS模型的建立，通过阴道涂片检查显示PCOS大鼠没有性周期（即一直处于动情间期），表明没有排卵。第42天，大鼠尾部取血测定空腹血糖值和胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）指数进行计算。HOMA-IR≥1.66用于确定IR大鼠的依据。

1.3.2 分组及给药

60只22日龄雌性SD大鼠按质量随机分为对照组（10只）和PCOS-IR造模组（50只），造模成功的大鼠分成模型组、Gen-低、中、高剂量组、二甲双胍组，每组8只。造模结束后，对照组和模型组不加Gen治疗，给予等体积花生油；各Gen剂量组分别给予Gen（溶于花生油）10、20、30 mg/(kg·d)，阳性对照组给予二甲双胍200 mg/(kg·d)，每日一次，连续21 d。

1.3.3 指标检测

1.3.3.1 大鼠阴道涂片方法

将待检测大鼠放到操作台上，清理身上垫料杂物，安抚至大鼠情绪稳定不反抗，用拇指和食指捏住尾巴，其余三指轻轻压住后腰和背部，然后翻起尾巴露出阴道口，将粪便清理干净，用蘸有少量生理盐水的棉签在大鼠阴轻轻道涂抹数次，涂片[18]，并用HE染液染色，显微镜观察。

1.3.3.2 血清指标测定

末次给药后，禁食禁水12 h，血糖仪测定大鼠空腹血糖值，试验结束后用乙醚对大鼠进行麻醉，腹主动脉取血，室温静置，以2000 r/min离心10 min，取血清，ELISA法检测定各组血清INS、APN、APPL1、PEPCK、RBP4表达水平。

1.3.3.3 RT-PCR检测卵巢组织内mRNA检测

8月17日，笔者走进冯新云的楼房，她正在给母亲按摩，她说，母亲把她养大不容易，现在是报答母亲的时候了，她要为母亲撑起一片蓝天。

按照动物组织RNA提取试剂盒说明书提取大鼠卵巢中RNA，测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行荧光定量PCR分析。引物序列见表1。

1.3.3.4 Western blot检测卵巢组织内蛋白检测

各组大鼠卵巢组织按照每30 mg组织样本加入250 μL体积的NP-40裂解液，裂解30 min，每间隔10 min涡旋振荡10 s使裂解更充分；裂解完成后，12 000 r/min离心10 min，然后取上清液，BCA法测定蛋白浓度。配制凝胶及电泳液，电泳后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入APPL1、RBP4、PEPCK、AMPK、p-AMPK一抗（均按1:500稀释），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤5次，加入相应二抗（1:1 000），37 ℃孵育1 h，TBST洗涤5次，滴加ECL化学发光液显影，凝胶成像系统进行分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.4 数据统计分析

实验数据采用SPSS 22.0分析，结果均以平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用ANOVA单因素分析，p≤0.05为差异性显著，p≤0.01为差异性极显著。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 结果与分析

2.1 建模情况分析

2.1.1 造模后大鼠动情周期

大鼠动情周期观察如图1所示，动情前期（图1a），相当于人体月经周期的卵泡早期，此期主要存在膨大椭圆、有核的上皮细胞，也有少量角化细胞或白细胞；动情期（图1b）相当于人体月经周期的排卵期，多见大量不规则、无核角化鳞状上皮细胞，呈树叶堆积状；动情后期（图1c）相当于人体月经周期的黄体期，会有白细胞、角化细胞和有核上皮细胞三种细胞形态，且三种细胞数量相当；动情间期（图1d）相当于人体月经周期的黄体后期，以白细胞为主，也可见少量上皮细胞。造模后，和对照组大鼠相比，PCOS大鼠连续处于动情间期（图1d）10 d，表明没有排卵，动情周期紊乱，而且PCOS大鼠形态肥胖，毛发浓密、体质量明显增加。上述结果表明PCOS大鼠建模成功。

图1 大鼠动情期Fig.1 Estrous period of rats

2.1.2 造模后各组大鼠胰岛素抵抗指数

图2 造模后各组大鼠胰岛素抵抗指数Fig.2 Insulin resistance index of rats in each group

2.2 Gen对大鼠生化指标的影响

2.2.1 Gen对大鼠体质量的影响

灌胃期间各组大鼠体质量变化如图所示，第7天各组大鼠体质量与第0天相比变化都为上升趋势，其中对照组和模型组体质量增长20～25 g，其他剂量组和二甲双胍组增加量较小；到第14天，对照组和模型组仍然处于上升趋势，但各剂量组和二甲双胍组有下降趋势，其中Gen-低剂量组下降25 g；经过21 d灌胃后，模型组体质量显著高于对照组62.17 g，与模型组相比，各剂量组体质量显著降低，其中Gen-低、中剂量组分别降低14.72%和12.51%。实验结果表明，Gen可有效减轻PCOS大鼠体质量。

图3 灌胃期间各组大鼠体质量Fig.3 Body weight of rats in each group during gavage

2.2.2 Gen对大鼠血糖指标的影响

表2 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数Table 2 FBG, Fins and HOMA-IR of rats in each group

各由表2可知，与对照组相比，模型组大鼠血清中FBG显著上升25.46%（p＜0.01），Fins含量和HOMA-IR指数分别显著增加1.95倍和2.71倍（p＜0.01），经过Gen灌胃21 d后各剂量组血糖值比模型组显著下降（p＜0.05），其中Gen-中剂量组降低了13.95%（p＜0.05）；Gen各剂量组空腹胰岛素与模型组相比有所下降，其中Gen-中、高剂量组分别降低45.80%、51.80%（p＜0.01）；与模型组相比，Gen各剂量组胰岛素抵抗指数显著下降（p＜0.01），其中Gen-高剂量组降低了57.20%。文献[19,20]报道，大豆异黄酮可有效防止糖尿病大鼠的氧化应激反应。Jayagopal等[21]给32例Ⅱ型糖尿病绝经后妇女饮食中添加12周植物雌激素（异黄酮132 mg/d），也发现植物雌激素可显著降低空腹血糖、空腹胰岛素水平，改善IR。本实验结果也证实不同剂量Gen可以降低PCOS-IR大鼠的空腹血糖值、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数。

2.3 Gen对大鼠血清APN、RBP4及相关指标的影响

各组大鼠血清中APN、APPL1、RBP4和PEPCK含量如表3所示。与对照组相比，模型组中脂联素、APPL1含量分别显著下降48.73%（p＜0.01）、27.86%（p＜0.05），Gen灌胃21 d后，与模型组比较，Gen低、中、高剂量组中APN、APPL1含量有不同程度的提高（p＜0.05），其中Gen-中剂量显著增加APN含量69.43%（p＜0.05）、显著增加APPL1含量36.57%（p＜0.05），且改善效果与二甲双胍组相当。脂联素是一种具有胰岛素增敏、抗动脉粥样硬化作用的脂肪因子，它可以通过与脂联素受体1（AdipoR1）和AdipoR2的相互作用进而调节卵巢功能[22-24]。含有PH结构域、PTB结构域和亮氨酸拉链基序1（APPL1）的接头蛋白是介导脂联素和胰岛素信号通路所必需的接头信号蛋白。APPL1在胰岛素和脂联素的几个靶组织，包括肝脏、骨骼肌、内皮、白色脂肪组织和胰岛中广泛表达[25]。研究[26]发现PCOS患者体内血清脂联素水平与胰岛素抵抗之间存在显著的负相关，而且体质指数（BMI）和脂联素之间无相关性，这表示胰岛素敏感性可能是脂联素水平的主要决定因素，而不是肥胖。Panidis等[27]研究发现PCOS患者血清中脂联素水平低于正常人群。Yildiz等[28]也有类似的发现，他们证明了胰岛素抵抗增加与脂联素水平降低之间的关系，证实脂联素可能是IR和由IR导致的糖尿病和代谢综合征的一个合适的标志物。本实验的研究结果与上述结果一致，模型组大鼠血清中的脂联素显著低于对照组，与脂联素变化趋势一致，APPL1含量显著低于对照组，经过Gen灌胃后有所改善。

表3 各组大鼠血清中APN、APPL1、RBP4和PEPCK水平Table 3 APN, APPL1, RBP4 and PEPCK levels of rats in each group

与对照组相比，模型组中RBP4、PEPCK含量显著上升63.83%、30.70%（p＜0.05），Gen灌胃21 d后，与模型组相比，Gen-低、中、高剂量组中RBP4、PEPCK含量有不同程度降低（p＜0.05），其中Gen-高剂量组RBP4含量显著下降59.01%（p＜0.05），Gen-中剂量组显著PEPCK含量显著下降22.63%（p＜0.05）。视黄醇结合蛋白4（RBP4）是一种与肥胖及Ⅱ型糖尿病的胰岛素抵抗有关的脂肪因子[29]。在肝脏中直接通过PEPCK途径对肝脏糖代谢产生影响[30]，抑制胰岛素信号的表达，改善胰岛素抵抗。Li等[31]发现PCOS患者的RBP4水平与胰岛素敏感性呈正相关，该蛋白是脂肪组织与胰岛素抵抗之间的重要蛋白。本实验的实验结果证实了上述研究内容，模型对照组的RBP4水平高于正常对照组，经过金雀异黄素灌胃后，各剂量组RBP4、PEPCK含量降低。

2.4 APN、RBP4、Fins含量和HOMA-IR指数相关性分析

Pearson法分析显示，PCOS大鼠血清脂联素含量与HOMA-IR呈负相关（p＜0.01），与Fins含量呈负相关（p＜0.05）RBP4含量与HOMA-IR、Fins含量呈正相关（p＜0.01），结果见表4。在多种遗传和饮食诱导的IR小鼠模型中，血清RBP4含量均显著升高，此后临床研究中发现血清RBP4与IR正相关[32]，故认为RBP4是一种参与IR发生的脂肪细胞因子[33]。而脂联素是目前发现的唯一对人体有保护作用的脂肪细胞因子，具有改善IR、改善糖代谢的作用。Shin等[34]报道血清RBP4与脂联素呈显著负相关，且多元逐步回归分析显示降低的血清脂联素含量是RBP4的独立相关因素。结果表明，PCOS-IR大鼠血清RBP4含量明显升高且与IR呈正相关，脂联素含量明显降低且与IR呈负相关，两种脂肪细胞因子在IR及糖代谢方面作用相反。

表4 脂联素、RBP4和胰岛素含量、胰岛素抵抗指数相关性Table 4 Correlation of adiponectin, RBP4 and Fins, insulin resistance index

图4 卵巢组织APPL1（a）、RBP4（b）、PEPCK（c）、AMPK（d）mRNA相对表达量Fig.4 Relative mRNA expression of APPL1 (a), RBP4 (b), PEPCK (c), AMPK (d) in ovarian

2.5 Gen对PCOS-IR大鼠卵巢组织相关mRNA和蛋白相对表达量的影响

各组大鼠卵巢组织中mRNA相对表达量如图4所示，模型组中APPL1、AMPK相对表达量显著低于对照组（p＜0.01、p＜0.01），Gen灌胃21 d后，Gen-低、中、高剂量组均可显著提高APPL1、AMPK含量（p＜0.01）；与对照组相比模型组中RBP4、PEPCK含量显著上升（p＜0.01）。与模型组相比，Gen低、中、高剂量组中RBP4、PEPCK含量有不同程度降低（p＜0.01）。

各组大鼠卵巢组织中APPL1、RBP4、PEPCK、AMPK、P-AMPK蛋白相对表达量如图5所示，模型组中APPL1、AMPK、P-AMPK相对表达量显著低于对照组（p＜0.01），Gen灌胃21 d后，Gen-低、中、高剂量组均可显著提高APPL1、AMPK、P-AMPK水平（p＜0.05或p＜0.01）；与对照组相比，模型组中RBP4、PEPCK水平显著上升（p＜0.01），与模型组相比，Gen-低、中、高剂量组中RBP4、PEPCK水平有不同程度降低（p＜0.01），Gen-中、高剂量组和二甲双胍组有着相似的治疗效果。

研究表明RBP4能够诱导PEPCK的表达量水平上升，另有文献显示脂联素能直接使PEPCK的表达下降[35]。研究发现，脂联素增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，机制可能是通过由含pH域衔接因子蛋白（APPL1）介导的脂联素信号转导通路，其可与脂联素受体相结合，进而激活AMP依赖蛋白激酶（AMPK）通路调糖代谢[36]。基于以上研究结果，本实验表明，Gen可以提高PCOS-IR大鼠卵巢组织中APPL1 mRNA和蛋白表达，降低RBP4、PEPCK mRNA和蛋白表达，激活AMPK通路，改善PCOS-IR大鼠空腹血糖血糖、胰岛素胰岛素抵抗现象。

图5 卵巢组织APPL1（a）、RBP4（b）、PEPCK（c）、AMPK（d）、P-AMPK（e）蛋白相对表达量Fig.5 Relative protein expression of APPL1 (a), RBP4 (b), PEPCK (c), AMPK (d), P-AMPK (e) in ovarian

3 结论

本研究结果表明，金雀异黄素对PCOS-IR大鼠糖代谢具有显著的调节作用，具体表现为降低大鼠血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数。此外，金雀异黄素可显著增加PCOS-IR大鼠血清中脂联素、APPL1含量，降低血清中RBP4、PEPCK含量，激活AMPK通路抑制PCOS-IR的胰岛素抵抗指数，改善糖代谢紊乱症状。综上，金雀异黄素具有调节PCOS-IR大鼠胰岛素抵抗的作用，该结论为金雀异黄素相关保健食品的开发和临床应用提供了一定的理论依据。