发酵过程中原花青素对大米淀粉多尺度结构及体外消化特性的调控

涂园，李晓玺，陆萍，陈玲，李琳

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

大米中的淀粉组分在米制品经过加工处理后经人体消化可快速转化为葡萄糖，为人体提供能量。但快速消化的淀粉容易提高人体餐后血糖生成指数（GI），进而增加消费者患上糖尿病和肥胖等相关慢性疾病的几率。

研究表明，在加工过程中，淀粉分子与食品中其他组分（如蛋白、脂质及多酚等）之间由于存在非共价相互作用可形成复合物，而不同加工条件又引起淀粉复合物结构的变化，继而影响淀粉类食品的消化和营养特性[1-5]。多酚广泛存在于果蔬和杂粮中，是食品中重要组分之一，且其对淀粉酶活性具有较佳的抑制效果[6]。因此，若采用适当的食品加工方式将多酚与淀粉分子进行复合，可明显延缓淀粉的消化性。

在传统米制品生产过程中，微生物发酵是常见的加工方式之一，其可赋予发酵米制品特有的风味及质构[3,7,8]。在微生物发酵过程，由于微生物所分泌酶对淀粉有降解作用，因此可导致淀粉链结构和聚集态结构发生不同程度的破坏[9]，使得淀粉分子间的氢键相解旋而使其具有良好的分子自由度。因此，发酵过程中淀粉分子自由度增加可促使其与体系中多酚分子的相互作用并发生复合，从而改变淀粉多尺度结构。同时，多酚在消化过程中又可抑制淀粉酶对淀粉的水解。因此，掌握多酚与大米淀粉的互作及多酚对淀粉结构的影响并建立其与消化性能之间的关系对调控发酵类淀粉食品的消化性能至关重要。

因此，本研究通过采用体外模拟消化等技术，研究了原花青素与发酵淀粉分子间的互作对淀粉多尺度结构的影响规律，揭示在发酵过程中原花青素与大米淀粉的结合对其消化性能的影响机制，为功能性发酵类食品的研发奠定基础。

1 实验材料和方法

1.1 实验试剂

大米，购置于广东太粮米业；酵母菌和乳酸菌，购自安琪酵母股份公司；原花青素C1，陕西森弗天然制品有限公司；GOPOD试剂盒，爱尔兰Megazyme；淀粉葡萄糖苷酶和猪胰酶，美国Sigma-Aldrich；其余采用分析纯试剂。

1.2 主要仪器设备

紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；恒温恒湿箱，上海一恒科学仪器有限公司；扫描电子显微镜，德国ZEISS；小角X射线散射仪，奥地利Anton Paar；傅里叶红外光谱仪和固体核磁共振仪，德国Bruker；凝胶渗透色谱仪，美国Waters。

1.3 实验方法

1.3.1 大米淀粉与原花青素的共同发酵

称取不同质量的原花青素C1（淀粉质量的2%、4%、8%），加入事先加了7%混合发酵剂（酵母菌:乳酸菌=3:1）的水中，分散后加入100 g大米淀粉（干基），按比例（大米淀粉:水=1:1.2）加水搅拌均匀。将混合后的浆液于恒温恒湿箱中进行发酵，发酵条件为：70%湿度、37 ℃、3 h。发酵后的样品冻干后置于烘箱中进行灭酶处理（50 ℃、30 min），样品经磨粉过筛后密封装袋待用。将样品命名为“发酵大米淀粉-原花青素添加量”，即FRS-0AC、FRS-2AC、FRS-4AC、FRS-8AC等，以未经发酵的原大米淀粉作为对照样品并命名为“Rice Starch”。

1.3.2 大米淀粉-原花青素复合物的消化性能

大米淀粉-原花青素复合物的消化性能根据 Englyst方法[10]进行测定，可获得大米淀粉-原花青素复合物的RDS、SDS和RS含量。

1.3.3 大米淀粉-原花青素复合物直链淀粉含量

大米淀粉-原花青素复合物中直链淀粉含量的测定参考GB/T 15683-2008。

1.3.4 大米淀粉-原花青素复合物层状结构

在大米淀粉-原花青素复合物样品中加入 70%的去离子水，并在室温下平衡 12 h后进行测定。采用SAXSquant 3.0软件和SAXSquant 2D软件进行数据处理[11,12]。利用一维线性相关函数分析 SAXS曲线0.2＜q＜1.4 nm-1区域并通过计算得到半结晶层状结构参数[13]，采用Chi[14]的方法计算SAXS曲线q=0.2～0.5 nm-1区域的斜率来计算表面/质量分形结构的分形维数。

1.3.5 大米淀粉-原花青素复合物结晶结构

测定前将样品置于恒湿环境中平衡12 h。其测试条件为：扫描速度是1.2 °/min，步长为0.02 °，扫描范围为5 °～40 °（2θ）。利用Peakfit-v4.12 软件计算淀粉的结晶度及A型和V型结晶比例[15]。

1.3.6 大米淀粉-原花青素复合物螺旋结构测定

利用13C CP/MAS NMR测定大米淀粉-原花青素复合物螺旋结构测定。核磁共振的测试参数条件设置为150.9 MHz的频率和10000 kHz的转速，接触时间为1 ms。利用Tan和Witt等人的方法进行分峰拟合并计算淀粉样品中的单螺旋和双螺旋含量[16,17]。

1.3.7 大米淀粉-原花青素复合物表面有序结构

傅里叶红外光谱（FT-IR）可以用于测定大米淀粉-原花青素复合物样品表面的有序结构。其测试条件为在4000至400 cm-1范围内扫描，以空气为背景。测定结束后，利用 Peakfit-v4.12软件对样品的红外光谱图（800～1200 cm-1）进行分峰处理，计算1042与1014 cm-1的强度比（R1042/1014），用于衡量淀粉短程有序化结构的含量[15]。

1.3.8 大米淀粉-原花青素复合物淀粉分子量

取5 mg样品与5 mL二甲基亚砜溶液（含50 mmol/L溴化锂）置于具塞试管中并混合均匀，将其进行沸水浴处理1 h以及水浴（60 ℃）振荡12 h。测定前，利用5.0 μm 滤膜对大米淀粉-多酚复合物样品进行过滤。流动相为采用超声脱气并经0.2 μm有机相过滤膜过滤的二甲基亚砜（含50 mmol/L溴化锂）；其中样品测试条件为：100 μL、0.7 mL/min、40 ℃以及λ=632.8 nm，其中样品中dn与dc的比值为0.074 g/mL，利用Astra软件对数据进行分析处理[18,19]。

1.4 数据处理

所有实验数据均取三次平均值，利用SPSS 20.0及LSD法分析各组数据之间的显著性差异水平（p＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 原花青素对发酵大米淀粉消化性能的影响

在微生物对大米淀粉进行发酵的过程中，原花青素的添加量对其颗粒消化性能的影响如表1所示。与未发酵大米淀粉对比，发酵后大米淀粉RS含量明显降低，原花青素加入后使得大米淀粉颗粒的RDS含量降低和 RS含量增加，且随原花青素添加量的增加RDS和RS含量变化程度明显提高；当原花青素添加量为 8%时，大米淀粉颗粒的 RS含量达到最大为66.85%。研究表明，淀粉酶的活性可被原花青素抑制[19]；同时，原花青素通过与淀粉结合形成复合物结构。原花青素对淀粉酶活性的抑制在发酵过程中能降低大米淀粉因微生物发酵而降解的程度，同时其还可通过与淀粉分子形成复合结构，进而降低淀粉的消化性能。因此，系统探讨发酵过程中原花青素如何影响大米淀粉的多尺度结构，对利用原花青素来调控大米淀粉消化性能的具有重要的研究意义。

表1 发酵协同原花青素复合对大米淀粉消化性能的影响（%）Table 1 Effect of fermentation and procyanidin complexation on the digestibility of rice starch (%)

2.2 原花青素对大米淀粉半结晶层状结构的影响

小角X射线散射技术可以考察在大米淀粉发酵过程中，原花青素对大米淀粉颗粒半结晶层状结构的影响，结果如图1和表2所示。

表2 发酵过程中添加不同原花青素后大米淀粉的半结晶层及分形结构特征Table 2 The lamellar parameters and fractal structure features of rice starch co-fermented with different amount of procyanidin

图1中q≈0.65 nm-1处的散射峰对应于淀粉的半结晶层状结构。由图1和表2可见，微生物发酵显著降低淀粉特征散射峰面积，即表明发酵后淀粉半结晶层状结构的有序程度降低；此外，微生物发酵可使淀粉半结晶层状结构的厚度（d）及结晶层的厚度（dc）增大，这是由于微生物胞外酶降解了半结晶层状结构中无定型层中支链淀粉分子并诱导其在临界结晶层处发生有序化重排。而在发酵过程中淀粉特征散射峰的峰面积随着原花青素添加量的增加而进一步降低，表明在发酵过程中原花青素的加入进一步降低了淀粉半结晶层结构的有序化程度。即原花青素对发酵大米淀粉半结晶层状结构有序化程度的破坏作用强于其对淀粉酶降解破坏淀粉有序化程度的抑制作用。同时，由表2可知，原花青素的添加可使大米淀粉半结晶层状结构中的无定型层厚度（da）显著降低、半结晶层厚度（d）及结晶层厚度（dc）显著增加，表明原花青素与淀粉分子二者间的相互作用可显著改变淀粉分子在半结晶层状结构中的分子排布方式。首先，原花青素可作为酶抑制剂显著降低微生物对大米淀粉半结晶层结构的破坏程度[20]；其次，原花青素在发酵中可通过氢键竞争性与淀粉分子发生分子间相互作用[11]，最终改变淀粉半结晶层状结构。由图1及表2可知，原花青素通过竞争性氢键相互作用破坏或抑制了淀粉分子间的原有氢键相互作用，进而降低半结晶层状结构中结晶层的有序化程度；同时，原花青素通过在淀粉分子间形成新的氢键相互作用，使得半结晶层状结构中无定型层的支链淀粉分子链或降解后的淀粉分子链形成相对有序的淀粉分子-原花青素-淀粉分子复合结构，才能使得发酵大米淀粉半结晶层状结构中无定型层厚度（da）显著降低、半结晶层厚度（d）及结晶层厚度（dc）增加。

淀粉的分形维数范围在 1＜α＜3时为质量分形结构，分形维数 Dm=α[21,22]。且淀粉分形维数越大，表明淀粉聚集的越紧密，其有序化程度越高。大米淀粉的分形维数拟合及其结果分别如图2和表2。经微生物发酵后，淀粉的分形维数降低，说明大米淀粉经发酵后其半结晶层状结构的整体有序化程度降低。而在此过程中由于原花青素的添加，大米淀粉的分形维数先增大（原花青素添加量＜4%）后降低（原花青素添加量＞4%），说明原花青素的添加显著改变其半结晶层状结构的整体有序化程度。在大米淀粉发酵过程中，根据原花青素对其半结晶层状结构厚度的影响可知，由于原花青素的介入，淀粉分子链与其二者间产生大量新的分子间氢键，可形成相对有序的复合物结构并提高半结晶层状结构中无定型层淀粉分子链的有序化程度；然而，在较高多酚添加量时，原花青素可能作为“增塑剂”抑制淀粉分子间的有序排列[23]，使得高添加量的原花青素条件下发酵大米淀粉半结晶层状结构的整体有序化程度反而降低。

2.3 原花青素对大米淀粉结晶结构的影响

发酵过程中原花青素对大米淀粉的结晶构型及相对结晶度（Relative crystallinity，RC）的影响如图 3及表3所示。微生物发酵前后，大米淀粉X射线衍射图谱均在15、17、18、23 °（2θ）附近出现A型结晶特征衍射峰[15]、约20 °（2θ）处出现V型结晶结构的衍射峰[23]，表明大米淀粉在微生物发酵前后均呈现A+V的复合结晶构型。经微生物发酵后，大米淀粉的相对结晶度及A型结晶比例明显下降，表明微生物发酵过程显著破坏淀粉的结晶结构。而在原花青素加入后，发酵大米淀粉的A型结晶比例、V型结晶比例及相对结晶度相对未添加原花青素的样品有显著降低，但该变化随原花青素添加量的变化没有显著性差异。再次说明，原花青素通过抑制大米淀粉颗粒被淀粉酶酶解从而延缓大米淀粉的结晶程度降低的同时，由于原花青素可在淀粉分子链间竞争性的形成氢键相互作用，破坏淀粉分子原有氢键相互作用及抑制淀粉分子间的进一步有序排列，因此，降低大米淀粉的A型结晶结构比例和相对结晶程度。而进一步增加原花青素添加量后，其与淀粉分子间竞争性形成氢键的程度以及V型结晶结构比例逐渐增加。由此可见，原花青素与淀粉分子间的竞争性氢键相互作用及相对有序复合物的形成是大米淀粉结晶结构改变的主要因素。

2.4 原花青素对大米淀粉螺旋结构的影响

大米淀粉颗粒螺旋结构在原花青素协同发酵过程中的变化如表3所示。微生物发酵显著降低大米淀粉整体双螺旋结构比例并提高无定型结构比例，对单螺旋结构没有显著影响。随着原花青素的添加，淀粉整体无定型结构比例逐步增加，双螺旋比例逐步降低。这与大米淀粉A型结晶比例及相对结晶度的变化趋势相一致。在发酵过程中，原花青素与淀粉分子因二者间存在竞争性氢键相互作用进而形成复合物，同时也破坏淀粉颗粒原有的双螺旋结构；而随着原花青素与淀粉分子间竞争性形成氢键的程度增加，新形成相对有序的复合物逐步增多，而该复合物主要有淀粉单螺旋分子链构成，且由于原花青素的增塑作用使得复合物中淀粉分子很难进一步聚集成双螺旋结构。因此，发酵大米淀粉的双螺旋结构明显降低，而单螺旋结构变化不大。这与大米淀粉发酵过程中，原花青素的添加对其不同结晶结构的影响规律相同。

2.5 原花青素对大米淀粉短程有序结构的影响

大米淀粉的红外光谱图及表面短程有序结构含量（R1042/1014）如图4及表3所示。大米淀粉的短程有序结构在微生物发酵后显著增加。这是因为大米淀粉颗粒表面短程无定型结构相对于短程有序结构更容易被降解，使得大米淀粉的短程有序结构含量相对增大，而发酵大米淀粉表面短程有序化程度在进一步添加原花青素后也逐步增加。再次证实，发酵过程中原花青素可与无定型区域的淀粉分子链或者被降解后的淀粉分子链发生竞争性氢键相互作用而形成相对有序的原花青素与淀粉分子复合物。

表3 发酵过程中添加不同原花青素后大米淀粉的多尺度结构特征参数分析Table 3 The analysis of multi-scale structural characteristic parameters of rice starch co-fermented with different amount of procyanidin

表4 原花青素协同发酵前后大米淀粉的分子量及其分布Table 4 The molecular mass and its distribution of rice starch co-fermented with different amount of procyanidin

2.6 原花青素对大米淀粉分子量及直链淀粉含量的影响

大米淀粉的重均分子量Mw及分子量分布变化见表 4。大米淀粉经微生物发酵后其分子量显著降低，且在Mw＜3×107g/mol的分子链片段显著增多。通过提高发酵过程中原花青素的添加量，淀粉分子的重均分子量逐步增大、淀粉分子在较大分子量范围内的分布增多，说明原花青素的添加降低了淀粉分子被微生物胞外酶降解的程度。一方面是原花青素作为酶抑制剂抑制微生物胞外酶的活性[20]，降低酶对淀粉分子的降解；另一方面是原花青素不仅与淀粉分子通过形成复合物来降低了淀粉的半结晶层结构有序化程度、结晶结构及双螺旋结构比例，其还可通过氢键作用促进无定型淀粉分子的排列，使得半结晶层厚度、结晶层厚度、分形维数、表面短程有序结构显著增大，抑制淀粉分子在发酵过程中的进一步降解。大米淀粉的直链淀粉含量在微生物发酵作用下略微有所增加。而原花青素的加入使得大米淀粉的直链淀粉含量逐步减少。原花青素与大米淀粉半结晶层状结构中无定型层支链淀粉相互作用并提高结晶层厚度，使得支链淀粉不易被微生物胞外酶作用而生成短直链淀粉分子。同时，直链淀粉所在的无定型背景区域易受微生物胞外酶的作用，而引起直链淀粉含量降低。

2.7 原花青素对大米淀粉多尺度结构及消化性能的影响机制

原花青素协同微生物发酵对大米淀粉多尺度结构和消化性能的影响分子机制如图5所示。在微生物发酵过程中，淀粉分子量降低（图5A）及淀粉半结晶层状结构、结晶结构、双螺旋结构均遭到破坏（图5C），整体有序化结构显著降低；而由于降解后的淀粉分子在此发酵过程中发生重排，大米淀粉的半结晶层状结构的厚度及结晶层厚度增加、V型结晶结构和单螺旋结构增加（图5B及5C）。而在发酵过程中原花青素的加入，促进了其与淀粉分子间形成的竞争性氢键相互作用，也显著改变大米淀粉多尺度结构进而引起其消化性能的变化。由上述大米淀粉在发酵过程中原花青素对其多尺度结构及消化性能的影响规律可知，原花青素协同发酵调控大米淀粉消化性能的机制如下：（1）原花青素可作为淀粉酶抑制剂，抑制微生物分泌的淀粉酶对大米淀粉分子链的降解（表4及图5D），从而可提高发酵大米淀粉的半结晶层及结晶层厚度（表2），从而延缓淀粉的无序化程度；（2）原花青素通过竞争性氢键相互作用降低半结晶层状结构中结晶层有序化程度、双螺旋结构、A型结晶结构、分子量的同时（表2、3、4及图5A），还可以与半结晶层状结构中无定型层的支链淀粉分子链或降解后的淀粉分子链形成相对有序的淀粉分子-原花青素-淀粉分子复合结构（图5E），使得发酵大米淀粉半结晶层状结构中结晶层厚度增大、无定型层厚度降低，聚集态结构紧密程度和表面短程有序化结构比例增加（表2、3、4及图5E和F），从而抑制淀粉酶对淀粉分子链的消化酶解。（3）淀粉与原花青素复合物在消化过程中由于淀粉分子链的部分降解，可缓慢释放原花青素，从而抑制淀粉酶对淀粉的降解。通过上述三方面的综合作用，最终显著降低经发酵后的大米淀粉消化性能。

3 结论

本文系统研究了原花青素在发酵过程中对大米淀粉结构及消化性能的影响和调控。研究结果表明，微生物发酵降解淀粉分子链并破坏半结晶层状结构、结晶结构和双螺旋结构，诱导大米淀粉颗粒无序化。原花青素复合协同微生物发酵过程中，原花青素抑制微生物胞外酶活性并降低淀粉分子的降解及聚集态结构无序化；此外，原花青素与淀粉分子形成淀粉分子-原花青素-淀粉分子的复合结构，使得淀粉半结晶层状结构中结晶层厚度增大、无定型层厚度降低，聚集态结构紧密程度和表面短程有序化结构比例增加，同时复合结构在消化过程中释放原花青素，在显著抑制淀粉酶活性的同时也最终提高发酵大米淀粉的RS含量。原花青素对淀粉酶活性的抑制及其与淀粉之间形成淀粉分子-原花青素-淀粉分子这样的复合结构是显著影响大米淀粉消化性能的重要因素。本研究不仅有助于分析发酵淀粉结构对其消化性能的影响机制，还可通过调控原花青素的添加量获得具有不同消化性能的发酵类淀粉制品。