银杏果酶解发酵前后风味成分的变化及主成分分析

姚芳，赵延胜，王海蓝，梁晓雪，祁兴普

（1.江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏泰州 225300）

（2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

银杏果又称白果，食药两用，营养丰富，含有银杏黄酮、银杏多肽、银杏酚、银杏内酯、银杏酸等多种活性成分[1]，具有益智健脑、降低胆固醇、抗氧化、抗衰老、提高免疫力[2-5]等多方面的食疗和药用价值，在功能食品领域具有巨大的发展潜力。

银杏果中含有60%以上的淀粉和13%以上的蛋白质，是优质的食品原料，国内外已有文献报道银杏果的营养成分、功能因子、毒性成分[6-8]，已有研究者对鲜银杏果和熟制银杏果的挥发性成分进行了分析[9-10]。因银杏果口感风味较差，会影响市场消费，去除青草味等不良风味是其精深加工的关键技术问题。目前主要将银杏果中活性成分提取出来作为辅料进行加工或在银杏果中加入其它原料进行复配加工以掩盖其不良风味，如银杏蛋白面包、银杏奶茶、银杏花生酸乳[11]等，资源利用率低，市场占有率也低，有关采用生物发酵法改善银杏果风味的研究未见报道，银杏果深加工迫在眉睫。

采用现代生物技术开发高品质的功能性食品是食品工业新的增长点，多菌种协同发酵是未来研究的主要方向，可为风味物质的形成提供丰富的酶和游离氨基酸、脂肪酸等各种前体物质[12]，通过微生物代谢对不良风味物质实现生物转化并产生愉快风味物质。植物乳杆菌是发酵食品中常用的微生物，酿酒酵母有利于产品品质和风味的形成，二者之间存在共生与互补关系[13]。本研究采用顶空固相微萃取-气质联用（SPME-GC-MS）技术分析不同酶解发酵方式下银杏果中挥发性风味物质的差异，并利用主成分分析法（PCA）进行比较分析，确定风味最佳的银杏果酶解发酵方式，以期为银杏果精深加工过程中风味控制提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

银杏果（大佛指），江苏中药科技园；中温α淀粉酶（4000 U/g）、糖化酶（100 U/mg），北京索莱宝科技有限公司；植物乳杆菌（Dy-1），江苏大学食品与生物工程学院实验室提供；酿酒酵母（冻干粉），江南大学生物发酵与分离研究室提供；MRS肉汤培养基（优级纯），北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B/5977A气相色谱—质谱联用仪、HP-1701毛细管柱（30 m×0.325 mm，0.25 μm），美国安捷伦公司；75 μm CAR/PDMS手动固相微萃取头，美国Supelco公司；1000A运邦不锈钢粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；JM-L80实验室胶体磨，温州昊星机械设备制造有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；Labconco FreeZone 6 L台式冻干机，美国LABCONCO公司；Thermo 702超低温冰箱，美国赛默飞世尔科技公司；PRIMOR高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher公司；DHG-9101-2S电热恒温鼓风干燥箱，上海三发科学仪器有限公司；AL204电子天平，梅特勒-托利多集团；MaxQ 4000恒温培养摇床，赛默飞世尔科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 银杏果的不同酶解发酵加工工艺

干燥粉碎样品（G）：鲜银杏果预煮1 h后去壳、去芯，捣碎，60 ℃干燥4 h，80 ℃干燥1 h、100 ℃干燥1 h、120 ℃干燥0.5 h，粉碎制成小于200目的银杏果粉。

单酶解样（A）：在干燥粉碎样的基础上，取100 g样加质量比为1:6的水，用胶体磨研磨3 min。置于沸水浴中加热搅拌20 min，取出冷却至60 ℃。添加银杏果重量0.3 g/100 g的糖化酶和α淀粉酶复合酶制剂，在60 ℃下搅拌酶解2 h，100 ℃下灭酶15 min，取出冷却至35 ℃，冷冻干燥。

单乳酸菌发酵样（B）：在干燥粉碎样的基础上，取100 g样加质量比为1:6的水，用胶体磨研磨3 min。置于沸水浴中加热搅拌20 min，取出冷却至35 ℃。加入3 g/100 g植物乳杆菌，32 ℃的恒温摇床发酵12 h，取出将全部料液倒入多个平皿中，先在-78 ℃中预冻2 h，然后放到冻干机中冷冻干燥。

乳酸菌+酵母菌联合发酵样（C）：在干燥粉碎样的基础上，取100 g样加质量比为1:6的水，用胶体磨研磨3 min。置于沸水浴中加热搅拌20 min，取出冷却至35 ℃。分别加入1.5 g/100 g植物乳杆菌和酿酒酵母，32 ℃的恒温摇床发酵12 h，冷冻干燥。

酶解+乳酸菌协同处理样（D），在单酶解的基础上，加入3 g/100 g植物乳杆菌，32 ℃的恒温摇床发酵12 h，冷冻干燥。

酶解+乳酸菌+酵母菌协同发酵样（E），在单酶解的基础上，分别加入1.5 g/100 g植物乳杆菌和酿酒酵母，32 ℃的恒温摇床发酵12 h，冷冻干燥。

1.3.2 挥发性风味物质测定

取2 g银杏果样品于20 mL固相微萃取顶空瓶中，聚四氟乙烯隔垫密封后在60 ℃平衡20 min，插入已老化的SPME萃取头（老化条件：250 ℃，2 h），60 ℃顶空吸附30 min，立即插入GC-MS进样口，解析3 min。

色谱条件：根据文献[10]，修改如下：HP-1701毛细管柱（30 m×0.325 mm，0.25 μm）；进样口采用不分流模式，温度230 ℃；载气（He）流量1.2 mL/min；溶剂延迟3 min；升温程序：初始温度30 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升至60 ℃，然后以2 ℃/min升至100 ℃，保持8 min，再以3 ℃/min升至120 ℃，保持10 min，最后以15 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

质谱条件：离子源EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃，涡轮泵转速100 r/min，质量扫描范围：35~550m/z。

挥发性风味物质分析：将检测出的化合物质谱数据，用NIST 14.L谱库检索匹配定性，采用峰面积归一法确定其相对含量[14]。

1.4 数据分析

每个数据重复测定3次，最终数据为平均值±标准偏差，采用SPSS 22.0统计软件进行主成分分析，旋转方法为凯撒正态化最大方差法。

2 结果与讨论

2.1 银杏果酶解发酵前后挥发性风味成分的变化

风味是食品的重要品质特征，发酵能改变产物中挥发性风味物质的含量和特征性风味物质组成，增强一些有益风味化合物，降解某些异味物质，最终改变产物的风味特征[15]。不同酶解发酵方式制得的银杏果粉中的挥发性风味物质经GC-MS检测鉴定，其色谱图结果见图1，其成分鉴定结果见表1，挥发性风味成分的含量与种类统计见表2，风味成分在不同酶解发酵加工方法下的相对含量差异见图2。

图1 不同酶解发酵方式的银杏果粉挥发性风味成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile flavor compounds in ginkgo seed powder by different enzymolysis and fermentation methods

图2 不同酶解发酵方式的银杏果粉挥发性风味物质的相对含量Fig.2 Relative content of volatile flavor compounds in ginkgo seed powder by different enzymolysis and fermentation methods

由表1、表2、图1、图2可知，不同酶解发酵方式制得的银杏果粉中共鉴定出挥发性风味成分212种，包括烃类102种、醛类12种、酸类21种、醇类26种、酯类34种、酚类4种、其它（酮类6种、醚类2种、杂环等5种）。银杏果经不同酶解发酵方式制备后其挥发性风味成分的种类和相对含量差异明显。G、A、B、C、D、E样品中分别鉴定出挥发性风味成分77、70、45、41、79、80种。G样品中烃类是风味物质的主要成分，其相对含量为78.21%，挥发性成分以2,2,4,6,6-五甲基庚烷、1-异丙基-4,7-二甲基六氢化萘、二甲基癸烷、四甲基辛烷、二甲基辛烷、壬醛为主，相对含量分别为15.59%、7.49%、6.32%、6.03%、4.10%、3.27%。2,2,4,6,6-五甲基庚烷具有刺激性作用，是荞麦中的主要香气成分[16]，银杏果经不同酶解发酵方式处理后其含量显著降低直至消失。G样品中δ荜澄茄烯、壬醛、二甲苯、衣兰烯、柠檬烯、α-白菖考烯等挥发性风味物质与周丽等[9]测定白果中风味物质的研究结果相符。A样品中烃类、醛类是风味物质的主要成分，其相对含量分别为47.51%、27.27%，挥发性成分以十一烷、壬醛、己醛、庚醛、异辛醇为主，相对含量分别为13.05%、9.61%、8.25%、3.39%、2.58%。十一烷吸入对身体有害，是烤烟烟叶的主要香气成分，银杏果经不同发酵方式处理后其含量显著降低。B样品中烃类、醛类、酮类是风味物质的主要成分，其相对含量分别为42.72%、19.98%、20.11%，挥发性成分以乙偶姻、壬醛、己醛、异辛醇、十一烷、2,2,4,6,6-五甲基庚烷为主，相对含量分别为20.11%、10.71%、5.05%、4.70%、4.35%、3.70%。乙偶姻是重要的奶香味食用香料，广泛存在于果酒中，银杏果经植物乳杆菌发酵后其含量显著增加。C样品中烃类、醛类、醇类是风味物质的主要成分，其相对含量分别为47.07%、21.90%、23.24%，挥发性成分以异戊醇、壬醛、二甲基癸烷、十一烷、2-甲基丙酸、异辛醇为主，相对含量分别为15.54%、13.89%、8.25%、6.24%、4.06%、4.00%。异戊醇具有水果香、酒香，是银杏果经植物乳杆菌、酿酒酵母联合发酵后的特有香气。D样品中烃类、酸类、醇类是风味物质的主要成分，其相对含量分别为38.51%、23.84%、17.99%，挥发性成分以乳酸、六甲基环三硅氧烷、3-甲基-2-己醇、十一烷、2-庚醇、1-己醇为主，相对含量分别为19.84%、9.71%、5.65%、4.95%、4.76%、2.75%。乳酸为糖在乳酸菌的作用下产生，银杏果经淀粉酶、植物乳杆菌协同处理后其含量最高。E样品中醇类、酯类是风味物质的主要成分，其相对含量分别为56.86%、19.58%，挥发性成分以苯乙醇、异戊醇、2,4,5-三氯苯基肉桂酸酯、2,3-丁二醇、3-甲硫基丙醇、乳酸为主，相对含量分别为25.79%、15.56%、13.29%、7.10%、3.67%、3.00%。苯乙醇具有玫瑰香、茉莉花香、面包香，是富含淀粉制品的重要呈香物质[17]。银杏果经淀粉酶协同植物乳杆菌、酿酒酵母协同发酵后醇类、酯类及酸类物质的种类和相对含量均增加，烃类物质的种类和相对含量下降，与王红丽[18]等的研究结果相符。

表1 不同酶解发酵方式的银杏果粉挥发性风味成分分析及相对含量Table 1 Identification and relative quantification of volatile flavor compounds in ginkgo seed powder by different enzymolysis and fermentation methods

表2 不同酶解发酵方式的银杏果粉挥发性风味成分的含量与种类Table 2 The groups and amounts of volatile flavor compounds in ginkgo seed powder by different enzymolysis and fermentation methods

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注：“-”表示未检出。

2.2 银杏果酶解发酵前后挥发性风味成分的分析

2.2.1 烃类物质分析

烃类物质可由烷基自由基脂质自氧化产生[19]，对风味贡献较小，不同酶解发酵方式的银杏果粉中烃类物质的种类和相对含量差异较大，其相对含量的大小顺序为G>A>C>B>D>E。G中烃类物质有53种，相对含量高达78.21%，E中烃类物质只有28种，相对含量低至9.46%，说明银杏果经不同酶解发酵方式制备后其烃类物质发生了转化，降解为醇类、酯类等香气物质。烃类物质中不饱和烃类对产品风味贡献较大，包括烯烃和芳香烃，其在不同样品中相对含量的大小顺序为G>A>D>C>B>E。G样品的不饱和烃类相对含量为15.54%，其中1-异丙基-4,7-二甲基六氢萘的相对含量最高为7.49%，它是香椿的特征挥发成分[20]，此外还具有α-胡椒烯、α-荜澄茄烯、衣兰烯、α-白菖考烯、反-菖蒲烯、D-柠檬烯等呈现特殊的果香和花香的烯烃类物质。G样品中2,2,4,6,6-五甲基庚烷、癸烷、二甲苯等对人体有刺激作用的有害成分含量最高，E样品中这些成分均未检出，且烷烃类物质减少对风味影响不大[21]，说明银杏果经淀粉酶协同植物乳杆菌、酿酒酵母混合发酵，不影响银杏果的风味，而且提高了产品的安全性。

2.2.2 醛类物质分析

醛类物质主要来源于原料中脂肪酸的氧化和蛋白质的Strecker降解反应[22]，阈值较低，对风味的贡献较大。不同酶解发酵方式的银杏果粉中醛类物质的种类和相对含量差异较大，其相对含量的大小顺序为A>C>B>G>D>E。A中醛类物质有7种，相对含量高达27.27%，E中醛类物质只有3种，相对含量低至0.98%。几种样品中壬醛、己醛、庚醛、苯甲醛、辛醛、癸醛的相对含量较高，其中壬醛在C样品中相对含量最高为13.89%，其次为B样品10.71%、A样品9.61%、G样品3.27%、D样品2.74%、E样品0.69%。壬醛、辛醛和癸醛是油酸的氧化产物，己醛是亚油酸的氧化产物，具有油脂味、青草味，是不良风味的重要来源[23]。A、B、C样品即银杏果分别经酶解、单植物乳杆菌发酵、植物乳杆菌和酿酒酵母联合发酵后，其壬醛、己醛、辛醛、癸醛和己醛的含量高，但经淀粉酶协同植物乳杆菌发酵的银杏果粉（D和E样品）中含量显著降低或未检出，可能转化成酯类，使样品气味愉悦。苯甲醛是苯丙氨酸的降解产物，产生臭味或苦杏仁味[24]，G、B、C样品中苯甲醛含量无显著差异，A样品即经复合淀粉酶酶解的银杏果粉中苯甲醛含量较高，D、E样品即淀粉酶协同植物乳杆菌发酵的银杏果粉中苯甲醛均未检出，说明植物乳杆菌发酵有助于苯甲醛的生物转化。

2.2.3 酸类物质分析

酸类物质主要来源于植物乳杆菌的发酵，其含量和种类取决于营养物质含量和酵母的使用[25]，不同酶解发酵方式的银杏果粉中酸类物质的种类和相对含量差异较大，其相对含量的大小顺序为D>E>C>A>B>G。D中酸类物质有8种，相对含量高达23.84%，G中酸类物质只有2种，相对含量低至0.68%。D样品中乳酸的相对含量最高为19.84%，其次是E样品为3%，可能是因为植物乳杆菌发酵产生的乳酸可与酿酒酵母发酵产生的醇类结合生成酯[26]，降低了E中乳酸的含量。己酸是E样品中的特有成分，具有香甜的干酪香气[27]。适量的酸味可赋予食品舒适、柔和的口味，与酯类、醇类物质含量配比恰当，有助于样品的呈香。

2.2.4 醇类物质分析

醇类物质是由酵母菌分解糖或氨基酸脱氨的代谢产物产生，赋予产品花香和水果香[28]，对风味具有重要作用。不同酶解发酵方式的银杏果粉中醇类物质的种类和相对含量差异较大，其相对含量的大小顺序为E>C>D>B>A>G，E和C样品均经过酿酒酵母发酵，其醇类物质含量较高。E中醇类物质有13种，相对含量高达56.86%，G中醇类物质只有4种，相对含量低至2.39%，说明银杏果经酿酒酵母发酵后醇类物质种类和相对含量显著增多，使风味有了明显改善。苯乙醇、异戊醇、2,3-丁二醇是E样品中的代表性成分，其相对含量分别为25.79%、15.56%、7.10%。苯乙醇可能来源于酿酒酵母对L-苯丙氨酸的生物转化，具有愉悦的玫瑰花香、茉莉花香且具有一定的杀菌作用[29]。异戊醇具有水果香、酒香，丁二醇可由苯丙氨酸降解产生，具有水果香[30]，均对银杏果风味带来积极的作用。

2.2.5 酯类物质分析

酯类物质是醇与羧酸和氨基酸发生酯化反应的产物[31]，大多数酯类具有令人愉悦的花果香。不同酶解发酵方式的银杏果粉中酯类物质的种类和相对含量差异较大，其相对含量的大小顺序为E>G>A>B>D>C。E中酯类物质有13种，相对含量高达19.58%，C中酯类物质只有1种，相对含量低至0.37%，说明银杏果经淀粉酶协同植物乳杆菌、酿酒酵母混合发酵后，其酯类物质是由酿酒酵母发酵产生的醇类与植物乳杆菌发酵产生的酸类在酶系催化下形成的[26]。2,4,5-三氯苯基肉桂酸酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯是E样品中的代表性成分，其相对含量分别为13.29%、2.56%、0.66%。辛酸乙酯具有杏子香、梨香和花香，癸酸乙酯具有菠萝香、椰子香、酒香[32]，是黄酒的特征风味组分[33]。其余几种样品中酯类物质相对含量较低，主要是因为酯类的挥发性较低，但对风味有弱的调节作用[21]。

2.2.6 酚类物质分析

酚类物质的相对含量较少，但具有一定的抗氧化功效，一般由酪氨酸降解[34]而来。6种样品中酚类物质的种类和相对含量都较低，但因其阈值低，对整体风味仍具有一定的影响。不同酶解发酵方式的银杏果粉中酚类物质的种类和相对含量差异较大，其相对含量的大小顺序为E>A>D>C>B>G。E中酚类物质有3种，相对含量为0.55%，G中无酚类物质。E样品中有甲酚、丁香酚、2,6-二叔丁基对甲酚3种酚类。2,6-二叔丁基对甲酚具有抗氧化性，丁香酚是E中特有成分，具有典型丁香香气，且阈值很低[35]。

2.2.7 其它类物质分析

其它类风味物质含酮类6种、醚类2种、杂环等5种，酮类物质一般来源于脂肪氧化降解和氨基酸降解[32]，阈值较高，对风味的贡献不大。除了B样品，其余5种样品中其它类风味物质的种类和相对含量都较低，B样品中乙偶姻（3-羟基丁酮）的相对含量最高，为20.11%。乙偶姻主要由2,3-丁二酮降解和α-乙酰乳酸经脱羧生成[36]，具有愉悦的奶香味。2-戊基呋喃具有青香味，是亚油酸的氧化产物，与腐臭味有较强的相关性，仅在A样品即酶解处理样品中检测出，说明银杏果采用发酵技术能去除2-戊基呋喃不良风味。

2.3 样品挥发性风味物质的主成分分析

2.3.1 挥发性风味物质的主成分特征值分析

利用SPSS对数据进行标准化，进行主成分分析，并计算权重。表3为6种银杏果粉中7类挥发性物质的主要成分特征值及贡献率，表4为主成分的特征向量及载荷分析。由表3、表4可知，提取的3个主成分的初始特征根均>1，累计贡献率达85.84%，丢失的信息较少，可反映样品的主要特征信息。第一主成分为49.86%，醛类和酸类的载荷系数（0.93、0.79）反应了其对第一主成分的贡献大，烃类与第一主成分呈负相关（0.97）；第二主成分为20.91%，醇类和酚类的载荷系数（0.90、0.54）反应了其对第二主成分的贡献，酯类与第二主成分呈负相关（0.69）；其它类反应了其对第三主成分（15.07%）的贡献（0.92）。挥发性风味物质的载荷大则对银杏果粉评分的影响大，即对风味贡献大。

表3 主成分特征值及贡献率Table 3 Characteristic value and contribution rate of principal components

表4 主成分特征向量及载荷分析Table 4 Principal component eigenvector and load analysis

2.3.2 建立挥发性风味物质的分类模型

根据主成分与特征向量之间的关系，由表4可以得到3个主成分的表达式：

式中X1~X7为原变量标准化变换后的标准变量，各系数为各风味物质的特征向量，计算后可得出6个样品各主成分的评分，如表5所示。以Y1、Y2、Y3三个主成分的各自方差贡献率与3个成分累计贡献率的比值为权重系数，建立银杏果挥发性风味物质分类评价模型，即Y=（0.4986Y1+0.2091Y2+0.1507Y3）/0.8584，经计算可得每种银杏果粉的综合评分Y，见表5。

表5 银杏果粉综合得分及分类Table 5 Comprehensive score and classification of ginkgo seed powder

GC-MS检测结果结合主成分分析建立综合评分模型可对样品的风味进行评分，反映银杏果经不同酶解发酵加工后产生的挥发性风味成分对样品风味的贡献[37]。由表5可知，G 综合得分<0，A、B、C、D、E综合得分均>0，说明银杏果经不同酶解发酵方式处理后其挥发性风味成分均发生了有利的改善。E样品的综合评分最高，G样品的绝对值最高。结合不同种类挥发性风味成分的种类与相对含量分析，E样品中的醇类、酯类等阈值较低的化合物相对含量较高，对风味贡献明显，而G样品中的烃类化合物相对含量很高但是其阈值较低，对风味贡献较少，虽然绝对值最高，但是对风味的影响呈负相关。所以，从挥发性风味分析的角度上，银杏果采用E方式即采用淀粉酶协同植物乳杆菌、酿酒酵母混合发酵对风味形成最有利。可能是因为淀粉酶的酶解为酿酒酵母的生长提供了大量的糖源，酿酒酵母可利用蔗糖、半乳糖进行酒精发酵，产生的乙醇与乳酸可发生酯化，减轻乳酸大量积累对乳酸菌生长的抑制作用，有利于乳酸菌的生长[38]，酶菌协同发酵更有利于醇类、酯类等令人愉悦风味物质的产生。

3 结论

3.1 采用顶空固相微萃取-气质联用技术对银杏果酶解发酵前后挥发性风味成分的变化进行了测定分析。结果表明：银杏果经不同酶解发酵方式制备后其挥发性风味成分的种类和相对含量差异明显。G、A、B、C、D、E样品中共鉴定出挥发性风味成分212种，分别为77、70、45、41、79、80种，主要包括烃类、醛类、酸类、醇类、酯类、酚类、酮类等。银杏果经淀粉酶协同植物乳杆菌、酿酒酵母混合发酵后（E）的风味最优，醇类、酯类化合物的种类和相对含量显著增加，烃类、醛类化合物的种类和相对含量显著下降；对银杏果青草味等不良风味起主要作用的壬醛、己醛、辛醛、癸醛、己醛、苯甲醛、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、癸烷、二甲苯等挥发性风味成分，经酶菌协同发酵其相对含量显著下降或未检出；产生了令人愉悦的苯乙醇（25.79%）、异戊醇（15.56%）、2,4,5-三氯苯基肉桂酸酯（13.29%）、2,3-丁二醇（7.10%）、3-甲硫基丙醇（3.67%）、乳酸（3.00%）等主要的风味成分，相对含量共68.41%；是因为酶菌协同发酵可生物转化不良风味，更有利于醇类、酯类等令人愉悦风味物质的产生。

3.2 利用主成分分析法将银杏果经不同酶解发酵方式制备的6种样品分成两类，G综合得分<0，A、B、C、D、E综合得分均>0，E样品的综合评分最高，说明银杏果经不同酶解发酵方式处理均有利于良好风味的形成，其中银杏果采用E方式对良好风味的形成最有利。不同品种、不同地点、不同生长环境等因素都会影响银杏果的风味成分，采用酶菌协同发酵可生物转化不良风味，为银杏果精深加工过程中风味控制提供支持，为银杏果的深加工提供理论依据。