湿粉生产中浸洗米工艺去除椰毒假单胞菌酵米面亚种污染分析

陈汉金，陈荣桥，朱文信，冼燕萍，侯向昶，吴玉銮，胡均鹏，刘冬虹，戴航

（广州质量监督检测研究院，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广州市食品安全检测技术重点实验室，广东广州 511447）

椰毒假单胞菌酵米面亚种（以下简称椰毒假单胞菌）可以分泌毒素米酵菌酸，米酵菌酸具有剧毒性，主要通过抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶(ANT)而产生毒性作用[1-3]，小鼠经口LD50为3.16 mg/kg[4-6]，由米酵菌酸引起的食物中毒，致死率可高达40%~100%[7]。我国21世纪初之前发生的米酵菌酸中毒事件大多集中在酵米面、吊耙浆及发泡木耳等食品[8-10]，这些食品多为家庭自制。然而，2018年和2020年，广东省发生了多起因食用湿米粉及淀粉制品（以下简称“湿粉”）引起的米酵菌酸中毒事件[11,12]，造成多人死亡，这些事件相关的湿粉都是来自于食品工业生产的成品，这种风险的严重性引起了社会和监管部门的高度重视。

本研究团队前期围绕湿粉生产加工过程展开了全方位的风险剖析，通过大量的原料样品（米、食用淀粉、水、食用油）和生产场所环境样品、湿粉样品的检测分析，于2020年6月~7月初期间，在湿粉生产的原料碎米和米浆中分离鉴定出椰毒假单胞菌，认为原料碎米为椰毒假单胞菌污染的主要来源，预警了潜在风险[13]。并在1起湿粉污染椰毒假单胞菌事件的2个湿粉样品和1个原料碎米样品中分离鉴定出椰毒假单胞菌，通过对菌株的全基因组重测序和构建SNP进化树进行溯源分析，发现这3个样品的菌株具有明显的聚类，表明湿粉中的椰毒假单胞菌很有可能来源于原料碎米中椰毒假单胞菌的污染。虽然前期研究发现了主要污染源，但是污染传递途径和传递过程还未明晰，因此亟需针对湿粉生产加工过程各环节的工艺特点进行风险分析研究，为此类风险防控提供科学的技术支撑。

湿粉的生产工艺主要为：

浸泡洗米过程中如果大米清洗不彻底会带来污染，浸洗时间过长也可能会滋生细菌。刘壮等[14]研究表明洗米过程会使得菌落总数增加；白芸等[15]研究了浸泡米时，低温（10 ℃）和pH值为2时对细菌总数和大肠菌群的生长抑制效果最佳；吴军辉等[16]研究表明调浆是最容易受微生物污染的环节。基于发现污染源来源于原料米，则需从源头开始，逐一对各工艺环节进行研究分析，本文主要针对目前湿粉生产企业采用的原料米浸泡和清洗工艺方式（据调研了解，主要为静态浸泡和动态缓慢搅拌清洗方式），在米表面制备椰毒假单胞菌膜，通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色技术来表征菌膜的形成，采用实验室模拟清洗及菌株检测技术进行研究，阐明该工艺操作是否能有效防控椰毒假单胞菌污染的传递。后续工艺的研究分析将另文介绍。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和米

选用前期研究从湿粉成品中分离的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株SZ1进行实验，该菌株已采用GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》[17]和全基因组重测序鉴定为产米酵菌酸的椰毒假单胞菌酵米面亚种。

实验用米采自湿粉生产企业，已根据GB/T 4789.29-2003进行检测，确定未检出椰毒假单胞菌酵米面亚种。

1.1.2 仪器与试剂

指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），购自国药集团化学试剂有限公司；GVC增菌培养基，马铃薯葡萄糖培养基，卵黄琼脂培养基，SS琼脂培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；VITEK 2 Compact自动微生物快速检测系统及其鉴定卡，法国梅里埃公司；ACQUITYTM超高效液相色谱仪和Waters XevoTMTQ MS三重四极杆串联质谱仪，Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 米表面菌膜的制备

分别称取25 g米于2组50 mL离心管（3个离心管/组）中，每组分别标记为S1、S2和S3。在S1和S2中分别加入2 mL浓度为109cfu/L的椰毒假单胞菌菌液，在S3中加入2 mL无菌生理盐水做参照，再在3个离心管中分别加入2 mL 0.5% TTC指示剂，混合均匀，置于36 ℃培养箱中培养72 h。然后，将S1中的米取出，均匀铺于培养皿中，于36 ℃培养箱中放置24 h，干燥，形成干菌膜粘附的米样品。

1.2.2 浸泡和清洗米

模拟湿粉生产企业目前普遍采用的静态浸泡清洗米（约1 h，换水清洗2次）和缓慢搅拌清洗米（换水清洗2次）的方式进行实验研究。

静态浸泡清洗按如下步骤进行：称取10 g已覆菌膜的米样品于50 mL离心管中，加入15 mL无菌盐水浸泡1 h后收集浸泡液；再用15 mL无菌盐水分多次冲洗离心管和米，以600 r/min转速涡旋1 min，收集清洗液；重复用15 mL无菌盐水再清洗1次，收集清洗液。

缓慢搅拌浸泡清洗按如下步骤进行：称取10 g已覆菌膜的米样品于50 mL离心管中，加入15 mL无菌盐水，以600 r/min转速涡旋30 min，收集浸泡液；再加入15 mL无菌盐水，以600 r/min转速涡旋10 min，收集清洗液；重复用15 mL无菌盐水再清洗1次，收集清洗液。

1.2.3 洗米水和米样品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的检测

根据GB/T 4789.29-2003检测上述各步骤各段收集的浸洗液、浸洗中脱落的菌膜以及清洗后米样品中的椰毒假单胞菌。

将毒力实验培养的椰毒假单胞菌毒素粗提取液，用甲醇-水（1:1，V/V）稀释适当倍数后，采用UPLC-MS/MS测定米酵菌酸。检测色谱条件为：BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0.0~3.0 min，50%~70% A，3.0~3.6 min，70%~95% A，3.6~5.5 min，95% A，5.5~5.6 min，95%~50% A，5.6~7.0 min，50% A；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。质谱条件为：电离方式为电喷雾负离子（ESI-）模式；毛细管电压2 kV，锥孔电压10 V；去溶剂温度500 ℃；去溶剂气为氮气，800 L/Hr；锥孔气为氮气，50 L/Hr；监测方式：多反应监测（MRM），米酵菌酸和异米酵菌酸的特征离子对（m/z）均为485.3/397.3和485.3/441.3（定量），碰撞能分别为20 eV和10 eV。

1.2.4 数据处理

本实验的图片数据均采用Adobe Photoshop进行处理，谱图数据采用origin 8进行处理，米酵菌酸的检测数据采用MassLynx软件进行处理。

2 结果与讨论

2.1 米表面形成菌膜的确认

TTC能够与活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应生成红色甲臜，常被用来表征鉴定种子活性[18]、生物体的损伤程度[19]以及用来排除样品中微生物鉴定的非活性物质干扰[20]，本实验中借助这一特性来表征米表面形成的生物膜。在米中加入TTC后，由于米表面存在复杂的微生物体系，样品S1、S2和S3培养72 h后都呈现红色，但显色程度略有差异。如图1所示，S1为经干燥处理后覆椰毒假单胞菌菌膜米的形貌图，呈明显暗红褐色；S2为未经干燥处理的表面湿润的覆椰毒假单胞菌菌膜米的形貌图，略呈暗红褐色；S3为空白对照，略呈较鲜明的红色，应为其他细菌与TTC作用显色。根据TTC的显色原理，表明米表面确实形成了一定程度的菌膜，尤其是米的侧角等不平整之处（如图1中的黑圈部位）。通过GB/T 4789.29-2003检测，在样品S1和S2中检出椰毒假单胞菌，在样品S3中未检出椰毒假单胞菌，表明所制备的覆菌膜米样品可以用于后续试验研究。

图1 样品S1、S2和S3覆菌膜培养72 h的形貌图Fig.1 Graph of sample S1, S2 and S3 cultured 72 h

2.2 浸泡和清洗米过程的外观变化

据调研了解，湿粉生产企业采用常温浸泡和清洗米，基于成本考虑，避免米粒之间或米与容器之间因大力摩擦作用掉渣而造成损失，所以一般采用静态浸泡清洗或缓慢搅拌浸泡清洗方式，加水量一般为高于米表面10~15 cm左右，主要除去米中一些质轻易漂浮在水面的杂质或一些小沙石杂质。静态浸泡清洗方式的浸泡时间一般约为40 min~1 h，然后通过泵抽上搅拌罐，缓慢搅拌、过水式清洗2次。缓慢搅拌浸泡清洗方式一般为连续缓慢搅拌约1 h，期间换水清洗2次。

本实验采用浸泡清洗1 h，换水清洗2次进行研究，图2显示了样品S1浸洗3次的实验观测结果。从外观上观察，静态浸洗和动态缓慢搅拌浸洗都能在一定程度上清除部分米上的微生物，表现为浸洗液显红色和浑浊，缓慢搅拌的浸洗液会比静态浸洗更浑浊，且缓慢搅拌的3次浸洗液中都有悬浮红色片状生物膜（图2中箭头指向部分），而静态浸洗液中几乎没有红色片状生物膜；静态浸洗3次后，米局部还可见较多类似片状的菌膜存在（图2中放大部位），而缓慢搅拌后的米样品中这种片状菌膜相对减少更多，这说明缓慢搅拌浸洗比静态浸洗可清洗掉更多的污染物质，这是由于搅拌动力促进了米粒之间以及米粒与容器之间的摩擦，加大了菌膜的清除效果。样品S2和S3浸洗过程的颜色变化与S1类似。但是，对于干燥菌膜的米和湿润菌膜的米，由于米表面不光滑、形状不规整，即使在缓慢搅拌作用力下，也不能将菌膜完全洗去，在米的边角部位仍可见红褐色的菌膜。

图2 样品S1在两种浸洗方式下的变化Fig.2 The variation of sample S1 rinsed by 2 ways

2.3 椰毒假单胞菌酵米面亚种鉴定

按照GB/T 4789.29-2003方法，对2种浸洗方式收集到的各次浸洗液、浸洗中脱落的菌膜以及清洗后的米样品检测椰毒假单胞菌。样品先在增菌培养基中培养48 h，再在PDA平板上划线培养后，细菌形貌图如图3所示（图中上层为样品S1缓慢搅拌清洗后的实验图，下层为样品S1静态浸洗后的实验图）。可在PDA平板中观察到典型的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌落，表现为表面湿润、呈乳白色、中心有些许凸起、边缘整齐且光滑等（如图3中黑圈所示），符合GB/T 4789.29-2003描述。在样品S2对应的浸洗液、浸洗中脱落的菌膜以及清洗后的米样品中也均可以观测到符合GB/T 4789.29-2003描述的典型的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌落；但在对照样品S3对应的浸洗液及清洗后的米样品中均未发现典型的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌落。

图3 S1浸泡液和浸洗米样品PDA平板疑似菌落形貌Fig.3 Suspected colony morphology on PDA of S1 soaking water and soaking rice

按照GB/T 4789.29-2003，对上述典型椰毒假单胞菌酵米面亚种菌落进一步鉴定，但是由于椰毒假单胞菌目前还没有成熟的定量检测方法，本实验只能进行定性研究。在卵黄琼脂平板培养48 h后呈现的菌落特征如图4所示，菌落表面光滑湿润，周围有乳白色圆环，在光照斜射下呈虹彩色，而在SS琼脂培养基中均未见生长，这明显符合椰毒假单胞菌酵米面亚种的特征。进一步用VITEK 2 Compact进行菌株鉴定以及进行毒力实验，结果确认均为椰毒假单胞菌酵米面亚种（实验对应小白鼠经口灌胃0.5 mL粗毒素后24 h内均死亡，米酵菌酸的检测谱图如图5所示）。在样品S1和S2的3次浸洗液、浸洗中脱落的菌膜以及浸洗后米样品中均检出椰毒假单胞菌酵米面亚种，证明了菌膜中的确含有椰毒假单胞菌，同时也表明通过浸泡清洗可以洗去部分椰毒假单胞菌酵米面亚种，但是并不能完全将污染菌清洗掉，即不能完全防控这种污染风险向下一生产环节传递。在前期研究的采自湿粉生产企业的米浆样品中检出椰毒假单胞菌酵米面亚种和米酵菌酸也证实了这个风险传递的可能性[10]。

图4 PDA中典型菌落对应的卵黄平板上菌株特征形貌Fig.4 The morphology of the strain on the Egg Yolk Agar Base corresponding to the typical colony in PDA

图5 米酵菌酸标准液（a）、动态浸洗米中分离菌株粗毒素（b）和静态浸洗米中提取菌株粗毒素（c）离子提取谱图Fig.5 Extraction ion chromatograms of bongkrekic acid standard solution (a), toxin of strain identified from dynamic rinsed rice (b), toxin of strain identified from static rinsed rice(c)

3 结论

3.1 原料米受到椰毒假单胞菌微生物污染后，在潮湿等适宜条件下可能会大量繁殖，并可能通过自身分泌物或共存的其他细菌的分泌物包裹在米表面，形成菌膜，尤其是在米表面较粗糙或死角部位易形成与米粘附较紧密的菌膜。本研究表明，椰毒假单胞菌可以参与米表面的菌膜生成，如果原料米已受到椰毒假单胞菌的污染，虽然静态浸洗和缓慢搅拌浸洗方式都无法保证彻底防控该污染的传递，但都可以在一定程度上消减该污染风险，且加大摩擦作用力对风险消减效果会更好。因此，建议湿粉生产企业严格落实原料米的进货查验制度和贮存制度，按照先进先出的原则使用，并加快周转，避免长时间存放，防止交叉污染；建议把浸洗米工序列为关键控制点，生产时必须严格执行浸洗米操作并做好记录，以降低相关风险，切莫为了控制成本而偷工减料。

3.2 另外，在企业调研时发现，湿粉生产行业通常为不连续生产，一般每天只生产6~8 h，不生产时浸洗米容器常见有积水和少量米残留，如果其中有椰毒假单胞菌残留，则可能容易大量繁殖，对下一班次生产造成污染，鉴于椰毒假单胞菌是条件致病菌，其最佳生长温度约为36 ℃，最佳产毒素米酵菌酸的温度约为26 ℃，而且要繁殖达到一定的细菌量才有可能在短时间内产生致死量的毒素，因此建议在班后加强对容器的清洗，保持容器洁净、干燥，并定期进行杀菌消毒，进一步降低风险。