放射性核素示踪技术在碳纳米颗粒生物效应研究中的应用

诸 颖，冉铁成，李晴暖，徐晶莹，李文新

中国科学院 上海应用物理研究所 核分析技术重点实验室，上海 201800

随着纳米科技持续迅速的发展，碳纳米材料的生物效应受到愈来愈广泛的关注。一方面，碳纳米材料由于其进入细胞的高效率，有望用于构建药物靶向输运系统的载体[1-2]；另一方面，随着碳纳米管和纳米碳黑的大量生产和应用，它们对环境和人类健康的潜在风险引起人们的担忧，其安全性已经成为当前毒理学研究的另一热点[3-4]。无论是作为药物载体的研制、还是生物安全性的研究和评估，都需要了解碳纳米材料如何与生命体系相互作用以及这种作用如何影响生命体系。而纳米材料进入生命体系以及随后在生命体内的吸收、分布、代谢、排泄则是研究两者相互作用和产生相关生物效应的重要基础。

与大多数化学分子或生物分子不同，目前缺乏可以用于碳纳米颗粒本身检测和分析的特异性反应，这成为研究碳纳米材料与生命体系相互作用的障碍。由于放射性核素发射的射线有相当高的探测灵敏度，因此，将放射性核素标记碳纳米颗粒、通过追踪放射性的行迹就能探测到碳纳米颗粒的位置和运动规律。放射性核素标记和示踪技术，由于方法简单、快速，结果直观可信，尤其可以检测复杂生物组织中的纳米颗粒的特点，在生物医药领域得到愈来愈广泛的应用。21世纪纳米科技的迅猛发展又为放射性示踪技术开辟了新的应用空间。本工作介绍了国内外放射性核素标记技术在碳纳米材料与生命体系相互作用研究中的应用。通过这些介绍不仅可以了解纳米材料与生命体系的相互作用及其科学意义，而且可以进一步认识到经典的放射化学技术在解决纳米科技和生命科学这个新的交叉领域研究中起到的关键作用。

1 放射性示踪技术研究碳纳米颗粒的体内生物分布

1.1 富勒烯衍生物的体内生物分布

富勒烯家族的典型代表C60，是由60个碳原子组成的具有中空笼状结构的球形分子，分子直径为0.71 nm。C60的特殊结构赋予其许多奇异的生物活性，包括选择性切割DNA、抗病毒、光动力学治疗、清除自由基、抗氧化和抑制生物酶活性等。同时，C60分子含有30个双键，具有高度的化学反应活性，可以连接上多种药物分子成为新的C60-药物偶联物。由于药物分子尺度增大、溶解特性改变以及C60基团本身的生物活性，使得这种新化合物有可能改进药物靶向性、增加药物生物利用度、降低药物的毒副作用，从而增进药物的治疗效果。因此，C60作为药物或药物载体在医药领域有着广泛的应用前景，C60衍生物的生物分布研究引起人们的极大兴趣。

(1) 富勒烯衍生物在正常动物体内的生物分布

富勒烯最简单的衍生物是富勒烯多羟基衍生物(富勒醇)和多羧酸衍生物，由于容易制取、水溶性高，因而受到特别的关注。Yamago[5]给小鼠口服14C标记的富勒烯羧酸衍生物，发现该衍生物只有少量被吸收，大部分随粪便排出。采用静脉注射方式给药后，大部分标记物在1 h内被迅速输送到各组织，48 h后90%聚集在肝中，很少有清除。注射一周后仅有2.4%标记物随粪便排出体外，滞留在器官组织里的不足2%，其余标记物分布在肌肉和鼠毛里。标记物在体内滞留时间很长，并具有逾越血脑屏障的能力，但无急性中毒现象。Cagle[6]用笼内含放射性166Ho的C82多羟基富勒醇，166Hox@C82(OH)y，研究了它在大鼠体内的分布，结果表明，除了血液流量少的地方外，166Hox@C82(OH)y在全身都有分布，在肝中选择性高度浓集，骨摄取居第二，清除均较慢，血池有不寻常的长时间残留。注射4 h后，除肾、脾、骨、肝外，其余组织和器官摄取都显著下降，脑中无摄取。标记物通过肾排泄，5天内排出20%完整的166Hox@C82(OH)y。

本研究组曾使用放射性核素99Tcm、125I 和67Ga标记了2种富勒烯多羟基衍生物，富勒醇C60(OH)x(x=22～24)和富勒醇环氧化物C60(OH)xOy(x+y=22～24)，研究了pH、浓度、温度和时间等对标记率的影响以及标记物的稳定性[7-12]。小鼠静脉注射后的生物分布结果指出，大部分标记物在1 h时被迅速输送到除脑外的各器官组织中，标记物具有微粒样的生物分布特征，容易富集在网状内皮系统，主要分布在肝、脾、骨等部位。富勒烯多羟基衍生物容易发生团聚，实验测定的粒径约20 nm，这可能是具有微粒样的生物分布特征的原因。此外，富勒醇在小鼠皮毛也有明显的摄取，标记物主要通过肾脏从尿道排出。99Tcm标记的富勒醇在新西兰大兔体内的单光子发射计算机断层(SPECT)图像显示的体内分布特征与小鼠尸解和放射性测量结果基本相符[9]。上述实验得到的生物分布资料为我们在富勒烯作为淋巴肿瘤靶向治疗药物和骨靶向药物的新药物设计和研究提供了实验依据[13-14]。

(2) 富勒烯衍生物在荷瘤动物中的生物分布

在C60分子上连接临床上使用的抗肿瘤药物，新的C60-药物偶联物是否会由于C60基团本身的生物活性和结构效应带来更好的抗肿瘤药效是很有意义的研究课题。紫杉醇是临床上常用的一线抗癌药物，已有报道，C60-紫杉醇衍生物具有缓释效果[19]，因而具有潜在应用价值，但是未见该化合物的体内分布和靶向性研究资料。淋巴道是癌细胞转移的重要通道，及时进行针对淋巴系统的治疗可以降低恶性肿瘤转移几率，减小外科手术切除范围，为原发灶的治疗争取宝贵时间，对提高患者的治愈率、生存率和治疗后的生活质量有重要意义。但是常规剂型的化疗药物没有淋巴靶向性，如上文所述，C60具有微粒样的生物分布特征，这使C60作为载体的抗癌药物容易通过毛细淋巴管壁内皮细胞间隙和内皮细胞的胞饮进入淋巴系统，因而有望构建淋巴靶向给药系统。经皮下或腔内注射以后，荷药微粒顺淋巴道移行，最后被载带到淋巴结并较长时间在淋巴结浓集，从而达到抑制癌细胞转移的目的。本研究组用临床使用的恶性肿瘤化疗药物氮芥，成功合成了C60-苯甲醛氮芥。进一步通过有机合成和随后的同位素交换反应得到苯环上标记有放射性核素125I的C60-苯甲醛氮芥[20]。将标记物行SD大鼠爪垫皮下注射。体内分布结果表明，C60-氮芥在胃和胃内容中的放射性摄取率最高，达60%ID/g；淋巴的摄取率也很高，约25%ID/g，仅次于胃，这提示该富勒烯衍生物有望用于胃癌治疗，同时具有抑制癌细胞顺淋巴道转移的功效。细胞水平的药效实验表明，C60-氮芥对癌细胞的抑制作用小于氮芥，但在对大鼠原位胃癌模型的药效分析实验表明，C60-氮芥的抑瘤效果远大于氮芥，两者的抑瘤率分别为69.7%和33.6%。更有意义的是，C60-氮芥能有效抑制肿瘤细胞的腹膜转移和淋巴结转移，转移率分别为0%和20%，明显优于氮芥的40%和50%[13]。该实验证明，C60-氮芥的更好药效并不是源于化合物细胞毒性的增强，而是化合物对胃和淋巴系统的高靶向性，与临床应用的氮芥相比，C60-氮芥可能是更有效且毒副作用更小的治疗胃癌的新药物。由此可见，放射性核素标记和示踪技术在纳米尺度靶向药物的设计、研制和实验验证中起着重要作用。

1.2 碳纳米管的体内生物分布

碳纳米管是由碳原子形成的石墨烯片层围绕中心按一定的螺旋角卷曲而成的无缝、中空的纳米管。按纳米管管壁层数分为单壁碳纳米管(SWNTs)和多壁碳纳米管(MWNTs)。在生物医药领域，碳纳米管是非常有效的细胞内输送药物的载体，有望构建新一类药物靶向输运体系。为了开展药物输运系统的研究和碳纳米管大量进入环境后的安全性评估，必须了解碳纳米管在生命体内的生物分布和代谢行为。

(1) 碳纳米管在正常小鼠体内的生物分布

自2002年北京大学王海芳等[21]首次用放射性核素标记和示踪技术开启了碳纳米管在小鼠体内分布的研究以来，几年中，纳米管的生物分布已经积累了比较丰富的资料[21-25]。研究过的碳纳米管有水溶性羟基化SWNTs[21, 23]，牛磺酸修饰的MWNTs[22, 24]和葡糖氨修饰的MWNTs[25]。使用的放射性核素有125I[21, 24]、14C[22]、131I[23]和99Tcm[25]。这些研究结果虽然存在一些差异，但总的生物分布特征基本一致。静脉注射后，检测时相从1 h[21]、10 min[22]缩短到仅2 min[23], 就观察到纳米管的体内分布，证明其可像小分子一样在体内各组织和器官间自由穿梭，迅速迁移。除了脑以外，大部分器官都有摄取，最高的摄取发生在网状内皮系统的肝和脾，此外，骨和肺也有较高的摄取。纳米管通过肾脏从尿液排泄，但体内清除很慢，静脉注射后90天，依然在肝和脾中能够检测到大量的纳米管。静脉注射、腹腔注射、灌胃、皮下注射等不同给药途径后，其生物分布无明显差异。Tween-80非共价修饰的MWNTs能显著降低网状内皮系统对MWNTs的摄取。

英、法和意大利的联合研究小组使用螯合分子二乙三氨五醋酸(DTPA)对长度为300～1 000 nm的SWNTs进行功能化修饰，然后将显像核素111In连接在DTPA上，实现了化学修饰的水溶性SWNTs的放射性标记。实验中，每只小鼠从尾静脉注射200 μL含60 μg(111In)DTPA-SWNTs的PBS溶液[26]，但是，生物分布测定结果与文献[21-25]有很大不同。标记物在网状内皮系统的肝、脾等没有明显的摄取和滞留，有趣的是肌肉、毛和肺却有异常的摄取。所有脏器和组织的放射性活度很快降低，血液清除很快，半衰期只有约3 h。标记物通过肾脏从尿液排出，且尿液中可以检出完整的原形SWNTs。

由于纳米颗粒的复杂性，有关生物效应的实验研究结果缺乏可比性，彼此矛盾的结果也时有发生。对于碳纳米颗粒体内生物分布的研究，今后应该给出有关纳米管形貌、尺度、功能化修饰和疏水性等性质的详细资料。要注意碳纳米管在放射性核素标记以后可能发生的特性变化，同时，放射性标记物的体内稳定性对实验测定的生物分布有非常重要的影响，一旦放射性核素从碳纳米管上脱落，示踪测量得到的是游离核素的生物分布，而不是碳纳米管的生物分布。

(2) 碳纳米管在荷瘤小鼠体内的生物分布

斯坦福大学的戴洪杰研究小组利用双功能偶联剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)将64Cu正电子核素连接在非共价修饰在SWNTs上的PEG上[27]。正电子发射计算机断层(PET)技术指出，经PEG非共价修饰的SWNTs在小鼠体内相当稳定，血液清除时间较长且在肝、脾等内皮网状系统有较高的摄取。在该纳米管的PEG链上接上精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)小肽后能使纳米管高效地靶向到小鼠皮下U87MG肿瘤，并且对生物体没有明显的毒副作用。对于分子量为5 400的PEG修饰的SWNTs，引入RGD，使肿瘤摄取从注入剂量的3%～4%增加到10%～15%；靶与非靶组织的摄取比增加到15。结果提示碳纳米管有望作为肿瘤早期诊断药物的载体。但是，肿瘤靶向治疗药物输运系统的研制，还需要进一步研究抗肿瘤药物在碳纳米管上的负载、药物在体内的释放或缓释以及纳米管的最终去向和生物安全性等[28]。

2 放射性示踪技术研究碳纳米颗粒的体外细胞摄取和分布

细胞是构成生命体的基本单元，外界任何生物活性因子对机体的作用，均可通过细胞的形态与功能的改变表现并检测出来。与动物模型相比，细胞模型具有较为简单、易于控制实验条件、实验结果重复性较好等优点。因此，大量碳纳米颗粒的生物效应研究都采用细胞模型进行。碳纳米颗粒与细胞相互作用的初始阶段就是纳米颗粒被细胞内化而进入细胞。研究纳米颗粒的细胞摄取及其在细胞内的分布是了解碳纳米颗粒细胞生物效应的重要基础。

放射性核素示踪技术用于碳纳米颗粒细胞摄取和分布的研究报道并不多见。2002年Foley等[29]研究了水溶性富勒烯的羧酸衍生物C61(CO2H)2与人纤维原细胞HS68的相互作用。使用荧光技术，证明了C61(CO2H)2穿越细胞膜进入细胞内；使用差速离心法收集各相应的细胞器组分，放射性计数结果表明该衍生物(14C-C61(CO2H)2)在线粒体分布最高，其次是细胞膜和微粒体，而细胞质液中最低。本研究组用125I和99Tcm分别标记了C60(OH)x，研究了标记物和L02细胞以及CHO细胞的相互作用，未发现这两种细胞对C60(OH)x有明显的摄取[30]。对于CHO细胞，细胞裂解液的放射性水平只有对照组的2～3倍，但依然可以看到，无血清细胞培养液中C60(OH)x的摄取率比有血清时的更高[30]。和C61(CO2H)2相比，C60(OH)x低的细胞摄取率可能起源于它们比C61(CO2H)2更高的水溶性，而血清蛋白通过和C60(OH)x相互作用进一步提高了后者的水溶性，导致更低的细胞摄取。

和水溶性富勒烯衍生物不同，碳纳米管和纳米碳黑(NCB)有非常高的细胞摄取[31]。本课题组用99Tcm成功标记了MWNTs和3种不同尺度的NCB[32]，定量检测了人宫颈癌细胞Hela对这些颗粒的摄取量。实验指出，碳纳米颗粒浓度为100 mg/L时，MWNTs和NCB在完全培养液中的细胞摄取率为10%左右，当培养液中无血清时，细胞摄取率增加到约30%[31, 33]。根据存活的细胞数，摄取率转换为每1 000个细胞对碳纳米颗粒的摄取量。对于直径分别为51、20、14 nm的3种NCB，每1 000个细胞摄取量分别为350、389、509 ng。可见，无血清条件下，细胞对3种不同尺度NCB的摄取具有明显尺度效应，粒径越小，摄取量越大，结果导致实验检测到的细胞毒性也越大[31, 33]。MWNTs的细胞摄取量与毒性关系不符合NCB的规律性，提示碳纳米管的细胞毒性机制不同于NCB，可能由纳米管制备时使用的金属催化剂残留所致[34-36]。实验揭示的细胞摄取与血清和纳米颗粒粒径的依赖性对于深入理解碳纳米颗粒与生物大分子的相互作用、纳米颗粒的细胞内化过程以及内化机制具有重要科学意义；对于提高基因治疗药物的转染率以及建立和规范碳纳米颗粒细胞毒性检测方法和评估标准等也有应用价值。由此可见，放射性核素示踪技术能够定量地描述碳纳米颗粒的细胞摄取，预期这将在纳米医药和纳米毒理学领域的研究中发挥更重要、更广泛的作用。

3 结论和展望

碳纳米颗粒经过放射性核素标记可以便利地用于纳米颗粒与生命体的相互作用研究，得到纳米颗粒在生命体内的吸收、分布、代谢和排泄等重要资料。这些量化资料对于纳米颗粒作为载体的药物设计、药效研究、纳米材料安全性研究和毒性评估等都起着重要作用。随着放射性核素成像的SPECT 和PET技术的迅速发展，特别是它们和CT 和MIR的图像融合技术的建立和推广，放射性核素标记和示踪技术使纳米颗粒在生命体内的行为和归宿可以用医学图像显示出来，这必将推动纳米科技和生命科学的交叉领域研究的更快发展。

在细胞层次的研究中，尽管传统的荧光标记和细胞成像已占有绝对优势，但放射性示踪技术在未来会有更大的发展空间。其中一个原因是荧光标记物的荧光信号不稳定，分析过程中容易淬灭，使定量分析的精确度欠高。然而，更重要的原因和碳纳米颗粒本身固有的奇异性质密切相关。碳纳米颗粒的奇异性质源于它们巨大的比表面以及由此带来的高反应活性。放射性检测的灵敏度高于荧光技术，标记在纳米颗粒上的放射性只需要少数放射性原子或无机小分子。相反，荧光标记需要更多、更大的有机荧光分子，其结果将在更大程度上改变碳纳米颗粒的表面性质，影响碳纳米颗粒生物活性的研究。近年来一些实验也证明，人们对荧光素干扰碳纳米材料生物活性研究的担忧不是没有根据。

纳米颗粒的放射性核素标记过程提出了不少属于放射化学的问题，这本身对经典的放射化学也是一项新挑战。14C的放射性标记中，核素是在碳纳米材料合成时引进的，因此几乎能够完全保持碳纳米材料原有的特性，但是这种标记技术只有少数实验室能进行，且14C寿命很长，影响检测的灵敏度。使用125I、131I和99Tcm等放射性核素在碳纳米颗粒上的直接标记都存在机制不清楚的问题，目前尚不知道核素是以共价还是非共价方式和纳米颗粒相结合，这也带来对标记物的体内外稳定性、标记物在体内的放射化学纯度等问题的担忧。若使用偶联剂对碳纳米颗粒进行非直接标记，则标记位点和机制明确，且稳定性也会提高，但可能带来标记后的纳米颗粒是否还保留其本身特性的问题。因此，碳纳米颗粒的放射性核素标记技术推动了碳纳米颗粒生物效应的研究，反过来，也给经典的放射化学提出了更多的研究课题。随着碳纳米管和富勒烯研究和应用的进一步深入和推广，以及碳纳米家族新成员，石墨烯片、石墨烯带和纳米金刚石的出现，放射化学必将在与纳米科技和纳米生物学的交叉研究中得到进一步的充实和发展。

致谢：感谢本课题组李宇国和尹娟娟博士提供有用的资料和帮助。

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