超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的64Cu标记、纯化及生物分布

史旭东，王 晓，申一鸣，孙钰林，梁积新，陈玉清，沈浪涛，＊

1．中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京 102413；2．原子高科股份有限公司，北京 102413

超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPION）以其较高的生物相容性和优良的磁学性质广泛应用于生物医学领域，如靶向药物载体、核磁共振成像造影剂、磁性细胞分离、DNA的纯化等［1］。以SPION为平台构建将正电子发射计算机断层显像（PET）探针和磁共振（MRI）造影剂相结合的PET／MRI双模态显像探针是当前极具挑战性的工作。SPION具有较强的可修饰性，可以通过各种手段将发射正电子的核素、多肽或抗体等靶向分子连接在其上面［2-4］。为了研发具有肿瘤靶向作用的PET／MRI双模态显像探针，本课题组使用多巴胺和聚乙二醇（PEG）衍生物对SPION进行了表面修饰，并在纳米粒子表面偶联了双功能螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸（DOTA）和精氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸环肽（cyclo（Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys，RGD），获得了平均粒径为（57±15）nm的PET／MRI双模态显像探针前体SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD（图1）［5-6］。近年来，作为优良的正电子显像核素，64Cu（T1／2＝12．7h；β＋：0．653MeV，17．4%；β-：0．578MeV，39%）正受到越来越多的关注。高比活度的64Cu可通过医用加速器生产。64Cu不但用于PET显像中，也用于放射性治疗药物的研究中。64Cu半衰期较长，可通过DOTA等双功能螯合剂与靶向生物分子偶联［7-9］，适用于耗时较长的合成操作，非常适合制备过程较为复杂的双模态显像探针的合成。但目前，磁性纳米粒子的64Cu标记率不是很高（20%～60%）［10-11］。因此，如何在磁性纳米粒子体系中，对64Cu的标记条件进行优化，从而获得较高的标记率，并选择适合于放射性纳米粒子纯化的手段，尽可能提高放化纯以满足体内研究的需要是急需解决的问题之一。

图1 超顺磁性氧化铁纳米粒子的结构示意图［5-6］Fig．1 Structure of SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD［5-6］

鉴于64Cu与双功能螯合剂DOTA的良好螯合性质及与纳米材料生物特性的匹配性，本工作拟使用64Cu对超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD进行放射性标记，并对标记、纯化条件进行摸索，对其体外稳定性和脂水分配系数进行测定，还通过该标记物在正常小鼠体内生物分布的研究，揭示其主要的代谢方式。

1 实验部分

1．1 试剂和仪器

超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD由本实验室制备［5-6］；64CuCl2，由原子高科股份有限公司提供；快速硅胶簿层层析纸（ITLC-SG），美国Pall公司；PD-10（Sephadex G-25）柱，美国GE公司。人血清白蛋白（HSA，质量分数为97%），上海莱士血液制品股份有限公司；二乙基三胺五乙酸（DTPA）、磷酸盐缓冲液（PBS）、醋酸铵（CH3COONH4）及其它化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。昆明小鼠15只，雌性，18～20g，北京华阜康生物科技股份有限公司。

1470自动γ计数器，美国Perkin Elmer公司；CRC-15放射性活度计，美国Capintec公司；AR-2000薄层扫描仪，德国Eckert Ziegler公司。

1．2 64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的制备

取100μL SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD醋酸铵缓冲溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加 入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，涡旋混匀，反应在一定温度条件下温育一段时间。

1．3 标记率和放化纯的测定方法

标记物的标记率（Y）及放化纯（RCP）均采用快速薄层层析法（ITLC）测定。取2μL反应液点样于ITLC-SG纸（10mm×100mm）上，于10%醋酸铵／甲醇体积比为1∶1的展开体系中上行展开，空气中自然晾干。用放射性薄层扫描仪进行扫描，计算标记率或放化纯。在展开体系中，游离的64Cu2＋或64Cu-DTPA随溶剂移到层析纸前沿，其Rf为0．9～1．0。而标记物64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD停留在原点，Rf为0～0．1。

1．4 最佳标记条件的选择

1．4．1 配体浓度对标记率的影响 分别取100μL Fe浓度为1．78、3．56、7．12、14．2mmol／L的SPIONdopa-PEG-DOTA／RGD的醋酸铵缓冲溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，涡旋混匀，50℃条件下温育60min，快速薄层层析法测定标记率。

1．4．2 反应时间对标记率的影响 取100μL Fe浓度为3．56mmol／L的SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD醋酸铵缓冲溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，涡旋混匀，50℃条件下温育，分别在反应40、50、60、70min后取样监测，快速薄层层析法测定标记率。

1．4．3 温度对标记率的影响 取100μL Fe浓度为3．56mmol／L的SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD醋酸铵缓冲溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，涡旋混匀，分别在40、50、60℃条件下温育60min，快速薄层层析法测定标记率。

1．5 标记物64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的纯化

取500μL Fe浓度为3．56mmol／L的SPIONdopa-PEG-DOTA／RGD醋酸铵缓冲溶液（pH＝6．5，0．1mol／L），加入2mL EP管中，并加入100μL（18．5MBq）64CuCl2，涡旋混匀，在50℃条件下温育60min。反应结束后待标记反应混合液冷却至室温，加入100μL 10mmol／L DTPA溶液，室温下温育20min，结合游离的64Cu。

标记物均采用PD-10柱排阻纯化：将PD-10柱用磷酸盐缓冲溶液（PBS，0．1mol／L，pH＝7．2）淋洗平衡后，加入反应混合物，PBS作为淋洗液，以每管0．5mL收集洗脱液，用活度计测量每管中的放射性活度。

1．6 标记物的体外稳定性考察

PBS体系：取64Cu标记的氧化铁纳米粒子约3．7×105Bq，置于200μL PBS中（pH＝7．2），涡旋混匀，37℃条件下，温育3、6、12h后分别采用快速薄层层析法测定放化纯，观察其体外稳定性。

HSA体系：取64Cu标记的氧化铁纳米粒子约3．7×105Bq，置于200μL 10%的人血清白蛋白HSA中，涡旋混匀，37℃条件下，温育3、6、12h后，依次取50μL混合液，加入50μL乙腈，涡旋1min，常温下5 000r／min下离心10min，取上清液，快速薄层层析法测定放化纯，观察其体外稳定性。

1．7 脂水分配系数的测定

取100μL标记物的磷酸盐缓冲溶液，加入到含3mL正辛醇和3mL磷酸盐缓冲溶液（pH＝7．2、0．01mol／L）的10mL离心试管中，盖好后充分震荡5min，在离心机中离心分层5min，转速为4 000r／min。分别取有机相和水相各500μL于干净测量管中，在γ计数器中分别测量其放射性计数，由有机相和水相的放射性计数的比值来计算脂水分配系数P，计算lg P。重复3次，取平均值。

1．8 标记物在正常小鼠体内的生物分布

取100μL64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的磷酸盐缓冲溶液，活度约为5．6×105Bq，经尾静脉注射到15只昆明小鼠体内，在注射后0．5、1、3、6、12h眼眶取血，处死并进行解剖，取心脏、肝脏、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、股骨、血等器官或组织称重，γ计数器上测量其计数。经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率（%ID／g）。

2 结果与讨论

2．1 最佳标记条件的选择

通过分别改变反应体系的配体用量、反应时间和温度等因素，确定64Cu-SPION-dopa-PEGDOTA／RGD的最佳标记条件。

2．1．1 配体Fe浓度对标记率的影响 在反应温度50℃、反应时间60min的条件下，考察配体Fe浓度（c（Fe））对标记率的影响，结果示于图2（a）。由图2（a）可知：配体用量对64Cu的标记率的影响较大，当配体中Fe浓度为1．78mmol／L时，标记率并不理想，仅为34%；当配体中Fe浓度增加到3．56mmol／L时，标记率得到了显著提高，达到了63%。然而，在继续增大配体量时，标记率没有呈现增大的趋势，反而出现了大幅的下降。因此，选择配体的Fe浓度为3．56mmol／L。

2．1．2 反应时间对标记率的影响 在配体Fe浓度3．56mmol／L、反应温度50℃条件下，考察反应时间对标记率的影响，不同反应时间对标记率的影响示于图2（b）。由图2（b）可知：反应时间的增长有利于标记率的提升，50min之后逐渐趋于稳定。因此，选择反应时间为60min。

2．1．3 温度对标记率的影响 在配体Fe浓度3．56mmol／L、反应时间60min条件下，考察反应温度对标记率的影响，不同温度条件下标记率的测定结果示于图2（c）。根据文献［12］，将初始反应温度定在40℃，标记率为31%。反应温度提高到50℃时，标记率达到了63%。由于氧化铁纳米粒子前体的稳定性受温度影响较大，高温条件下容易发生团聚甚至出现沉淀的现象，当温度升高到60℃时已经出现标记率的下降，因此，没有进行更高温度条件下的标记实验，反应温度定在50℃。文献［10-11］报道，纳米材料的64Cu标记率在20%～60%之间。通过配体Fe浓度、反应时间和温度对标记率的影响研究发现，在优化条件下，64Cu的标记率可提高至63%。虽然，在文献中未见64Cu标记率较低的原因分析，但我们推测，在纳米材料体系中不能通过无限制地提高温度的方式来提高标记率，因为附着在纳米材料表面的高分子随温度升高将脱落，导致团聚乃至沉淀现象；此外，由于结合在纳米材料上的螯合基团（DOTA）是有限的，并且这些螯合基团还可能被PEG覆盖，处于不利于与64Cu结合的状态，因此，即使提高配体Fe的浓度也不能提高标记率。这些因素都可能是导致纳米材料体系中64Cu标记率不高的原因。

图2 配体Fe浓度（a）、反应时间（b）、反应温度（c）对标记率（Y）的影响Fig．2 Influences of ligand concentration（a），reaction time（b）and reaction temperature（c）on labeling efficiency

2．2 标记化合物的纯化

标记物采用PD-10柱纯化。在标记反应混合溶液中加入过量的DTPA，结合游离的和非特异结合在纳米材料上的64Cu［13-14］，而64Cu-DTPA与标记物64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在PD-10柱中的保留时间存在明显差异，通过收集不同时间点的洗脱液可以实现标记物的纯化。纯化后产物经薄层层析法检测后发现，标记物基本全部集中在原点（图3（b）），Rf＝0～0．1。这说明64Cu已成功标记至SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD，且放化纯大于95%。在本研究的初始阶段，参考64Cu标记DOTA及其衍生物的条件进行标记并直接采用排阻色谱进行分离，但通过纸色谱最终放化纯的分析发现很难将标记物完全分离。在纯化过程中没有加入DTPA，直接将标记反应混合溶液在PD-10柱上洗脱，但最终的标记物放化纯（图3（a））并不理想，只有71%。这说明DTPA对游离铜的螯合作用对于该标记物的分离十分重要。DTPA的作用可能与文献［13-14］的解释类似，即通过DTPA与PEG的竞争，除去在PEG上非特异结合的64Cu，使之转化为64Cu-DTPA，从而极大地改善了分离效果。

2．3 标记物的体外稳定性考察

放射性药物必须要有足够的体外稳定性。64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的体外稳定性检测结果示于图4。由图4可知，标记物在37℃下温育，在0．1mol／L磷酸盐缓冲溶液（PBS）和体积分数为10%的人血清白蛋白（HSA）溶液中均比较稳定，放置12h后，放化纯（RCP）仅略有下降，但仍大于90%。说明该标记物的体外稳定性良好，可以用于进一步的体内研究。

图4 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在HSA和PBS中的稳定性Fig．4 Stability of 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD in HSA and PBS

2．4 脂水分配系数的测定

64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的 脂水分配系数P为0．054 40，lg P值为-1．27，药物表现出较高的水溶性，这归结于PEG衍生物对纳米粒子的表面修饰，从而有助于药物在体内的转运分布，延长其体内的循环半衰期，从而使该探针更有效地作用于靶点。

2．5 标记物在正常小鼠中的体内分布

正常小鼠体内64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在各器官的生物分布结果列入表1。由表1可知：放射性标记物在肝脏（（8．42±0．32）%ID／g，30min）、脾脏（（3．55±0．51）%ID／g，30min）和肾（（5．99±0．61）%ID／g，30min）中的吸收最高，而其他器官对药物的摄取相对较低，表明该标记物主要通过肝、脾代谢，肾脏排泄，这与粒径小于100nm的纳米粒子在体内的生物分布和代谢途径基本一致［15-16］。体内的网状内皮系统（RES，包括肝、脾、肺和骨髓等组织）具有丰富的吞噬细胞，可将一定大小的纳米颗粒作为异物而摄取，较大的颗粒由于不能滤过毛细血管，而被截留于某些部位。粒径100～200nm的颗粒很快被网状内皮系统的巨噬细胞从血液中清除，最终到达kupffer细胞的溶酶体中；50～100nm的颗粒可以进入肝实质细胞，而小于50nm的纳米粒子则通过淋巴系统传递到脾和骨髓中［17］。

表1 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在正常小鼠体内分布Table 1 Biodistribution of 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD in normal mice

3 结 论

以超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD为前体，使用正电子核素64Cu对其进行了放射性标记。通过改变反应体系的配体用量、反应时间和温度等因素，得到优化后的标记条件为：配体中Fe浓度为3．56mmol／L，反应时间为60min，反应温度为50℃，经优化后的标记率可达到63%。通过加入DTPA螯合游离和非特异结合在纳米材料上的64Cu并使用PD-10柱进行纯化后，得到了放化纯大于95%的标记物，解决了氧化铁纳米材料64Cu标记物不易纯化的难题。该标记物在12h内表现出了较高的体外稳定性且具有良好的水溶性。正常小鼠体内的生物分布揭示了其主要的代谢方式，该标记物可用于后续的PET／MRI双模态显像的研究。

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