淫羊藿总黄酮微波提取工艺研究

周国保 张文清

(1.江西省化学工业学校，江西 南昌 330012;2.华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237)

1 引言

淫羊藿是一种全草类药材，其中有效成分为黄酮类化合物，这类化合物总称为“淫羊藿总黄酮”，含量约1.01% ～ 8.81%［1］，药典［2］规定“不得少于 5.0%”。利用淫羊藿总黄酮提取物开发新药，具有广阔的应用前景。淫羊藿总黄酮的提取方法主要有水提法或醇提取法，提取辅助手段包括高压、超声波，以及微波［3］等。本课题主要针对醇提法提取过程，研究并确定微波辅助条件下的工艺条件和提取效果。

2 试剂和仪器

2.1 试剂

无水乙醇(AR)，天津大茂化学试剂厂;甲醇(AR)，江西同盟试剂化工厂;乙腈(色谱级)，上海陆忠工贸有限公司;淫羊藿苷(Icariin)化学对照品，批号∶110737－200312、110956－200312，中国药品生物制品检定所;淫羊藿原料，“奇珍”牌淫羊藿饮片，生产批号∶2005091701，徽沪谯中药饮片厂出品，原料产地∶江西;种类∶朝鲜淫羊藿。

2.2 仪器

超声波清洗器，TH－300BQ;蒸馏水装置，自备;紫外可见光分光光度计，T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司;高效液相色谱仪，岛津LC－20AT配SPD－20A紫外检测器;微波炉，家用格兰士微波炉WP700(21)，功率700W，频率2450MHz，自改造;真空干燥器，DZF6020，南京神威制药设备有限公司。

3 淫羊藿原料及提取物中有效成分的分析方法

淫羊藿原料及提取物中有效成分的分析涉及淫羊藿总黄酮含量和淫羊藿苷含量。参照药典2010版中“淫羊藿”药材标准中［含量测定］项下总黄酮测定的规范，使用紫外－可见光分光光度法，检测波长为270nm，以淫羊藿苷为对照品，采用外标法可测定总黄酮含量。参照药典2010版中“淫羊藿”药材标准中［含量测定］项下淫羊藿苷的测定规范，使用高效液相色谱法，C18柱，以乙腈－水(30∶70)为流动相，检测波长为270nm，以淫羊藿苷为对照品，采用外标法可测定总淫羊藿苷含量。

3.1 总黄酮含量分析

测定条件∶10mm厚石英比色皿，以甲醇为参比溶液，检测波长270nm。总黄酮标准标准曲线方程C=27.296A－0.573。吸光度A与浓度 C的线性关系良好，线性范围∶4.16～20.8μg/mL。根据吸光度 A 和标准曲线方程可计算得到试样中总黄酮的浓度C。

3.2 淫羊藿苷分析

测定条件∶色谱柱 kromasil C184.6×250mm，检测波长270nm，流动相乙腈∶水(30∶70)，流速为1mL/min，进样量20μL。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。以淫羊藿苷标准溶液浓度为横坐标，HPLC峰面积为纵坐标，在色谱工作站中绘制标准曲线，线性范围∶19.6～98.0μg/mL，淫羊藿苷峰面积 A 与浓度 C 的线性关系良好。根据HPLC峰面积，由色谱工作站再解析(外标法)，可得到试样中淫羊藿苷的浓度C。

参照药典2010版中“淫羊藿”药材标准中［含量测定］项下总黄酮测定的规范和淫羊藿苷的测定规范，取淫羊藿饮片粉末(过三号筛)0.2g左右，从制样开始，到对供试品溶液的测定。重复三次。测得淫羊藿饮片中总黄酮含量为3.76%，淫羊藿苷含量0.56% 。

3.3 提取物中有效成分的分析方法

(1)干浸膏中有效成分的分析

取干浸膏10mg左右，干燥至恒重，精确称重，于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，经0.45μm的滤膜过滤，得到淫羊藿苷测定的供试品溶液，可用于淫羊藿苷含量测定。取淫羊藿苷测定的供试品溶液2mL或3mL或4mL，于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得总黄酮测定的供试品溶液，可用于总黄酮含量测定。

(2)提取液中有效成分的分析

量取一定量试样溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，经0.45μm的滤膜过滤，得淫羊藿苷测定的供试品溶液(介于 19.6 ～98.0μg/mL)，可用于淫羊藿苷含量测定。再取淫羊藿苷测定的供试品溶液一定量，于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得总黄酮测定的供试品溶液(介于4.16 ～20.8μg/mL)，可用于总黄酮含量测定。

4 微波辅助提取的实验方法

4.1 提取预实验

为选取提取溶剂的浓度，安排提取预实验。

(1)提取设备

微波辅助提取设备利用家用微波炉进行改造。

(2)预实验中提取过程

称取片状淫羊藿饮片10g，粉碎，放入三口烧瓶。考察不同溶剂水、55%乙醇溶液(v%)、65%乙醇溶液(v%)、75%乙醇溶液(v%)的提取效果，溶剂体积为100ml。微波炉功率为27%*700W，微波下提取时间为30min。提取液过滤、浓缩，直到瓶中残液剩下20ml左右，转入50ml容量瓶，75%乙醇溶液稀释至刻度，得到50mL定容液。取样分析其中总黄酮和淫羊藿苷的含量。

4.2 微波提取与传统工艺比较实验

在该研究步骤中，欲采用正交试验考察有无微波辅助和不同粗细试样情况下的提取效果，水平设计如表1所示。实验可采用L4(23)表进行，如表2所示。

提取过程∶10.0g试样重复提取两次，第一次所用溶剂为140mL的乙醇溶液(浓度按预实验结果优选)，第二次所用溶剂为100mL的乙醇溶液;每次提取时间为30min。若采用微波辅助则加热功率定为27%×700W。若不采用微波辅助则使用电热套加热。均在回流下提取。细的试样采用粉碎机打碎，粗的试样只用粉刀粉细。所得提取液分别75%乙醇溶液定容于50ml容量瓶，得到50mL定容液。

表1 比较试验中各因素的水平

表2 L4(23)实验设计

4.3 微波辅助提取优化实验

在文献［3］中，研究了微波辅助水提淫羊藿有效成分的过程，认为提取收率与预处理过程润湿剂种类、浓度、用量、润湿时间、润湿后微波辐射时间、提取中水用量、微波提取时间等因素有关。

本研究在确定溶剂、原料粗细及辅助手段等因素下，主要从溶剂用量、微波辐射时间、微波提取时间、提取次数等4个因素进行考察，优化工艺条件。由于考察因素包括4个因素，因而采用L9(34)正交试验方案，各因素的水平确定如表3。正交试验表采用L9(34)，正交试验设计，如表4所示。

表3 L9(34)正交试验中各因素的水平

表4 L9(34)正交试验设计

3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1

提取过程∶10.0g试样放入三口烧瓶，装入微波炉，用微波辐射预处理设定的时间。在该三口烧瓶中加入定量的溶剂(按正交设计，溶剂浓度由预实验优选)，微波功率27%*700W，时间定于设定的提取时间刻度上，重复提取设计规定的次数。滤液收集、合并。滤液浓缩直到瓶中残液剩下20ml左右，转入50ml容量瓶，用75%乙醇溶液定容至50mL(5 mL/g淫羊藿饮片)。

5 提取工艺研究结果与讨论

5.1 预实验中结果与讨论

在预实验中，分别测定提取液中的总黄酮和淫羊藿的含量，并计算在淫羊藿饮片中的百分含量，结果分别列于表5。

表5 不同提取溶剂对提取效果的影响

表5中的结果表明，水作溶剂时提取效果不如水醇(乙醇溶液)作溶剂的提取效果。不同乙醇溶液作溶剂提取效果不同，以65%乙醇溶液最好。提取溶剂选65%乙醇溶液。

5.2 比较实验中结果与讨论

比较实验结果，如表6所示。

表6 比较试验的结果

(1)比较实验结果分析

FA=6775.2 ＞161.0=F1－α(FA，fe)，因素 A(有无微波辅助)作用显著;

FB=308 ＞161.0=F1－α(FB，fe)，因素 B(试样粗与细)作用显著。

(2)比较实验结论与讨论

①微波辅助提取工艺比传统的回流提取工艺效果更好

按综合评分的方差分析，因素A(有无微波辅助)在显著水平α=0.05下，作用显著。因而，淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷的提取工艺中采用微波辅助更好。

②药材原料粗细对提取效果影响不大，但适当粉碎更好

按综合评分的方差分析，因素B(试样粗与细)在显著水平α=0.05下，作用显著。因而对药材原料粉碎，不仅有利于有效成分收率提高，而且有利提取设备容积利用率提高。

5.3 优化实验中的结果与优化条件

根据优化实验的过程和方法，进行正交试验，并对9次试验的50mL定容液分别测定淫羊藿苷浓度和总黄酮含量并计算收率，结果列于表7。

表7 优化实验中正交试验的结果

(1)优化实验的结果分析

根据综合评分的方差分析，因素A、因素D作用显著。最优水平组合为［A3，(B2)，(C2)，D3］，即溶剂用量(65%乙醇溶液体积，mL)为饮片重量(g)的14倍(第二、三为12倍)，微波辐射时间为1.5min，微波提取时间为20min，提取次数为3次。

(2)优化实验的优化工艺条件

综合考虑，在微波辅助提取下，淫羊藿总黄酮提取的最佳工艺条件∶溶剂用量(65%乙醇溶液的体积，mL)为饮片重量(g)的14倍(第二、三次为12倍)，微波提取时间为20min，提取次数为3次。饮片需要被粉碎，使之变小。

6 结论

(1)比较了水提、55%(v%)乙醇溶液提取、65%(v%)乙醇溶液提取、75%(v%)乙醇溶液对淫羊藿总黄酮的提取效果，65%(v%)乙醇溶液提取率最高。

(2)比较了微波辅助和无微波辅助、不同粗细原料的提取过程，微波辅助提取率高，原料粗细影响不大。

(3)在微波辅助提取下，最佳工艺条件∶以65%乙醇为提取溶剂，提取三次，各次溶剂用量(ml)与饮片重量(g)比为 1∶14、1∶12、1∶12，每次微波提取时间为20min。

(4)根据验证实验，在微波辅助提取的最佳工艺条件下所得的提取液中总黄酮对原料饮片的收率为4.58%，淫羊藿苷对原料饮片的收率为0.88% 。获得的淫羊藿干浸膏对淫羊藿原料的平均收率10.7%，其中总黄酮含量29.7%，淫羊藿苷含量2.54% 。

［1］李薇.常用中药薄层色谱鉴定［M］.北京∶化学工业出版社，2005.

［2］国家药典委员会.中人民共和国药典2010版(一部)［S］.北京∶中国医药科技出版社，2010.

［3］黄瑞华.微波辅助水提淫羊藿有效成分的研究［D］.上海∶华东理工大学，2004.