超声波提取草莓多糖的工艺研究

李粉玲 蔡汉权 林曼莎

(广东韩山师范学院，广东 潮州 521041)

多糖的种类很多，其中的活性多糖可以刺激免疫活性，能增强网状内皮系统吞噬肿瘤细胞的作用，促进淋巴细胞转化，激活T细胞和B细胞，并促进抗体的形成。从而在一定程度上具有抗肿瘤的活性。但对于肿瘤细胞并无直接的杀伤作用。活性多糖能降低甲基胆蒽诱发肿瘤的发生率，对一些易发生广泛转移，不宜采取手术治疗和放射疗法的白血病，淋巴瘤等。当前，对多糖的研究方兴未艾，关于多糖的生物活性、作用机制、构效关系以及结构修饰等一直是研究的重点，对于指导多糖应用开发和加速多糖产业化进程具有重要作用。［1，2］

多糖作为水果中的一类重要结构物质与功能物质，在各种水果中均大量存在。水果多糖不仅赋予其水果特定的感官品质，而且在保鲜等方面也有显著的作用。近年来对水果多糖的研究已渐渐深入，大量的水果资源已被利用，我国是水果生产大国，拥有丰富的水果资源，这就为水果多糖的分离提取提供了大量价格低廉的原料，也为水果多糖的产业化应用提供了较大发展空间。［3］

草莓，别名洋莓、地莓、地果、红莓等。草莓属蔷薇科。《本草纲目》注释:补脾气，固元气，制伏亢阳，扶持衰土，壮精神，益气，宽痞，消痰，解酒毒，止酒后发渴，利头目，开心益志。对人体有较大的药用价值，总糖含量高。本实验将利用超声波技术这一现代手段辅助提取草莓多糖。

多糖的提取方法有水提醇沉法、酶解法、微波法、膜处理法、超声波辅助提取法等。本实验采用超声波辅助提取法(Ultrasonic assisted extraction)。［4］是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物溶出速度和溶出次数，缩短提取时间的浸提方法。超声波提取法具有提取效率高、提取时间短、提取温度低、适应性广、提取药液杂质少、提取工艺运行成本低等优点。超声波提取水果多糖具有提取时间短、得率高，操作方便等优点。［5］

本实验用苯酚－硫酸法测定多糖含量，在490 nm波长处有特征吸收，测定多糖含量。测定吸光度时所用葡萄糖标准溶液与莲雾多糖都需现配现用才能保证结果的稳定性及准确性，每组需平行测定3次。用分光光度法测定草莓中多糖的含量，此方法简单，准确率高。且生成的颜色持久，用苯酚－硫酸法测定多糖含量时需注意苯酚浓度不宜太高，这样反应的稳定性不好且易产生操作误差。本实验采用5%浓度的苯酚，测定结果较为理想。同时保持较高的硫酸浓度对多糖含量测定非常重要，因此该呈色反应是以对多糖的水解和糠醛反应为基础的，硫酸浓度降低会影响两种反应的进行。［6，7］

1 实验材料、试剂与仪器

1.1 材料

草莓(采自潮州市)。

1.2 试剂

葡萄糖标准品，95%乙醇、苯酚、浓硫酸及其他试剂均为分析纯。

5.0%苯酚试剂的配制:称取苯酚100 g，加铝片0.1g和 NaHCO30.05g蒸馏，收集1820C馏分。称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用，得5.0%苯酚试剂。

葡萄糖标准溶液的配制:准确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1g，加适量水溶解，转移至100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度摇匀，制得浓度为1mg/mL的葡萄糖溶液，再准确移取10mL，用蒸馏水定容至100mL，得0.1mg/mL的葡萄糖标准液。

1.3 仪器

移液管，吸量管;容量瓶;碘量瓶;离心管;试管;

722SP可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);

SHD－III循环水式多用真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂);

101A－1型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司);

冷藏冷冻箱(BCD－217YBHaier);

FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);

KDM型调温电热套(山东鄄城永兴仪器厂);

800型离心沉淀器(上海手术器械厂);

粉碎机。

2 实验方法

2.1 草莓多糖的提取工艺

2.1.1 草莓的预处理

2.1.1.1 将草莓洗净切碎，放在101A－1型电热鼓风干燥箱以60℃左右烘烤，粉碎，过40目筛，于试剂瓶中密封备用。

2.1.1.2 准确称取 10.00g草莓粉于索氏提取器中用石油醚(80℃)回流脱脂两次，1 h/次，每次60 mL。用无水乙醇回流提取两次，1h/次，每次60 mL。除去单糖和低聚糖，将其烘干。［8］进行称重。将其平均分成10份，记录每份样品的重量。按照此步骤处理样品50.00g 。

2.2 提取工艺

草莓清洗→烘干(50—70℃)→粉碎→加一定量蒸馏水→超声提取→过滤→浓缩→加乙醇得粗多糖→重新溶解→加Savage试剂脱蛋白、加高岭土脱色→萃取→过滤→定容→测定多糖含量

2.3 多糖含量的测定:苯酚 －硫酸法

葡萄糖标准曲线制作:分别吸取葡萄糖标准液(0.1 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加水稀释至 1mL，向各管中加入5%苯酚试剂1mL，混匀。沿管壁加入浓硫酸5mL，静置5min，振摇，定容至25ml比色管，振摇，置沸水浴中加热15min，立即转入冷水浴中冷却至室温。以蒸馏水为空白，在490nm波长处测定吸光度。

2.4 回归方程的建立

以葡萄糖的含量(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标制作标准曲线得直线回归方程y=2.07x+0.02920，r=0.9899 。

表1 葡萄糖标准曲线制作

标准曲线如图1。

图1 葡萄糖标准曲线Figure 1 glucose standard curve

2.5 草莓多糖含量测定

取草莓多糖浸提液溶于适量蒸馏水中，转移到100mL容量瓶中，定容。精密吸取上述溶液1.0mL，按“标准曲线制作”项下操作，测定吸光度，根据回归方程求出含量。

计算公式:

式中c为标准曲线上查得的葡萄糖浓度(mg/mL)，V为草莓多糖溶液稀释后的总体积(mL)，W为提取多糖时称取的草莓重量(g)。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 单因素试验工艺流程

取5份回流烘干好的草莓粉末分别放入5个碘量瓶中，按一定比例加入蒸馏水(料液比)，在合适功率(超声波功率)下超声波浸提数分钟(浸提时间)，浸提结束后趁热减压抽滤，收集滤液。

加热浓缩至2－3mL(原料重:浓缩液=1:2)。

上清液加入8mL体积的无水乙醇，充分搅拌，放入冰箱中静置2小时，沉淀物用无水乙醇洗涤，如此重复数次，直到乙醇接近无色，得到的沉淀即为粗多糖。

得到的粗多糖加50mL的蒸馏水使其重新溶解，加入 Sevage 试剂［9，10］(正丁醇:氯仿 =5:1)，振荡15min，加高岭土0.1g，混匀，静置2小时，脱去蛋白、脱色，过滤，取其滤液，用蒸馏水溶解后定容100mL容量瓶中，利用苯酚－硫酸法测其吸光度A，根据回归方程可算出多糖的含量W。

原料的超声波浸提时间、超声波功率、料液比以及超声波浸提次数对多糖的提取结果均有影响，据以上流程，在单因素试验的基础上，以多糖提取量为指标进行正交试验，确定超声波萃取草莓多糖的最佳条件。以提取多糖的因素为横坐标，多糖含量(mg/g)为纵坐标做图分析比较。

3.1.2 超声波浸提时间对草莓多糖提取的影响

取5份回流烘干好的草莓粉末分别置于250mL碘量瓶中，按照料液比1∶40加入40mL水，在超声波功率 60%(300W)条件下分别浸提 10、15、20、25、30min，趁热过滤，苯酚 －硫酸法测定多糖的提取量。结果见图2。

图2 草莓多糖含量与超声波浸提时间的关系Figure2 Effects of microwave extraction time on the content of strawberry polysaccharide

从图2看出超声波加热浸提20min时多糖提取量最大，浸提时间小于20min多糖提取不充分，浸提时间大于20min，随着时间的延长，多糖提取量逐渐降低，说明超声波浸提时间对多糖的提取有影响。

3.3.2 超声波浸提功率对草莓多糖提取的影响

取5份回流烘干好的草莓粉末分别置于250mL碘量瓶中，加入40mL蒸馏水，分别在20%、40%、60%、80%、100%(100%功率为500W)功率下加热浸提20min，趁热过滤，苯酚 －硫酸法测定多糖含量计算提取量，结果见图3。

图3 草莓多糖含量与超声波浸提功率的关系Figure 3 Effects of microwave power on the content of strawberry polysaccharide

由图3看出草莓多糖的提取量先是随着超声波功率的增加而增大，功率60%时多糖提取量最大。由图可见，超声波提取功率对多糖的提取有显著的影响。

3.3.3 料液比对草莓多糖提取的影响

将5份回流烘干好的草莓粉末分别置于250mL碘量瓶中，按料液比 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入相应体积的水，超声波功率60%(300W)，加热浸提20min，测定多糖提取量，结果见图4。

图4 草莓多糖含量与料液比的关系Figure 4 Effects of solid－liquid ratio on the content of strawberry polysaccharide

由上图可以知道，当料液比是1:50的时候，提取率达到最高，所以选择料液比为1:50为最佳提取条件。

3.3.4 超声波浸提次数对草莓多糖提取量的影响

将3份回流烘干好的草莓粉末分别置于250mL碘量瓶中，根据上述试验所得最佳浸提条件:浸提时间20min、微波功率80%，料液比1:50、研究多糖浸提次数对多糖提取量的影响，分别浸提一至三次，结果见图5。

图5 草莓多糖含量与超声波浸提次数的关系Figure 5 Effects of times on the content of strawberry polysaccharide

由图5可看出二次浸提时样品液中多糖含量达到最大值，因此二次浸提为最佳的浸提次数。

3.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上 ，经预实验确定以提取时间，提取功率，料液比和提取次数为因素，设计四因素三水平的L9(34)正交试验，试验设计及结果见表2，表3。

表2 正交实验因素水平表

表3 L9(34)正交试验设计及试验结果

表2中极差值大小反映出影响草莓多糖提取率的主次因素顺序为:浸提时间＞超声波功率＞浸提次数＞料液比，经方差分析显示浸提时间和料液比是显著影响因素。

4 结论

4.1 实验结果

本实验通过三水平四因素正交试验，确定了草莓多糖的最佳提取条件，即为:超声波浸提时间为25min、超声波功率60%(3000W)、料液比1∶40，浸提次数2次，草莓多糖在该条件下的提取量达到14.97mg/g。

4.2 前景展望

近几年来研究较多的是草莓的冰温保鲜技术以及草莓果实总DNA提取技术的改进，目前对植物多糖的提取技术有较深入的研究，对于提取果实多糖的研究，目前仍处于初始研究阶段，相关文献只表明草莓具有丰富的营养价值，总糖含量高，因此研究如何利用超声波提取草莓多糖，大大提高了草莓的利用价值，具有一定的开发意义。

［1］郑宇东，郑金贵，曾绍校.果蔬多糖的研究现状及应用前景［J］.食品科学，2003，2(1):152 －155.

［2］王庭欣，朱惠民，周明河.植物多糖抑瘤活性的研究进展［J］.癌变畸形突变，2000，12(2):118 －120.

［3］刘杰超，焦中高，周红平，王思新.水果活性多糖的研究现状与展望［J］.食品科学，2008，29(10):675－678.

［4］杨宇博，夏红梅，袁恒翼.植物多糖及其提取方法［J］.2008，6(2):34 －37.

［5］徐建平，魏燕华.超声波提取法对白花蛇舌草中熊果酸含量的影响［J］.2010，5(42):330－332.

［6］勾建刚，刘春红.白茅根多糖超声提取的优化［J］.时珍国医国药，2007，18(11):2749 －2750.

［7］董群.改良的苯酚－硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究［J］.中国药学杂志，1996，31(9):550.

［8］张桂，赵国群.超声波萃取植物多糖的研究［J］.食品科技，2005，(26):9，302 －304.

［9］李峰，刘延吉，宗绪岩，等.草本刺嫩芽根多糖脱蛋白方法研究［J］.安徽农业科学，2006，34(1):9－10.

［10］郭育东，单斌，李敏仪.苦瓜多糖脱蛋白方法的比较研究［J］.安徽农业科学，2009，37(7):3225－3227.