CTAB-已烷体系萃取芦丁的正萃研究

时间：2024-07-28

黄佳欣吴碧君聂琦梁诗韵胡满根

(1.南昌大学食品学院；2.南昌大学化学学院，江西南昌 330031)

黄酮类物质广泛存在与自然界的天然产物，是许多中草药的活性成分。研究表明黄酮类物质具有抗氧化、抗肿瘤、消炎抑菌、降血糖以及增强免疫力等生物学功效。传统的分离方法如柱色谱法[2]和有机溶剂萃取法在许多领域已经有了广泛运用，但却难以应用于食品级黄酮类物质的纯化。原因在于大量的有机溶剂的使用会导致某些黄酮类物质的构象发生改变，从而降低其药效甚至失效。另一方面，大量有机溶剂的使用还会造成有机溶剂残留，从而使最终产品具有一定的生物毒性。因此急需研究和开发易于工业化的、高效的黄酮类物质的分离纯化方法。反胶束体系是近些年发展起来的一种高效的、适用于工业化生产的生物活性物质分离纯化技术。反胶束是表面活性剂分子在非极性有机溶剂中超过临界浓度而自发形成的具有热力学稳定性的纳米级聚集体，其亲水性的极性腔的性质接近于细胞内的环境，从而保护生物活性物质的性质不发生改变[5]。该方法已广泛适用于蛋白质、酶、生物碱等生物活性物质的分离，并取得较好的结果。

本文以芦丁为黄酮类物质的代表，对反胶束体系分离黄酮类物质的条件进行了前期探索。考察了表面活性剂和溶剂种类对萃取效果的影响，建立了以十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂，正己烷为溶剂的反胶束正向萃取体系。详细考察了助溶剂的用量、表明活性剂的用量及振荡时间对芦丁正萃的影响。确定了芦丁正向萃取的最佳条件。

1.实验部分

1.1 仪器与试剂

SP-723型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，康氏振荡器(江苏省金坛市荣华仪器有限公司)；KQ2200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AL104电子分析天平(METTLER TOLEDO)。

芦丁、CTAB、十二烷基磺酸钠(SDS)、大豆卵磷脂(HLB)、聚氧乙烯月桂醚(BRJ35)、正辛烷、异辛烷、正己烷、正庚烷、环己烷、正己醇均为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)。

芦丁溶液：精密称取一定量的芦丁加入到100ml的70%乙醇中，超声使其充分溶解，得到浓度即为芦丁溶液，临用现配。

1.2 实验方法

1.2.1 正向萃取实验

对照品溶液的制备：将一定比例的反胶束溶液和芦丁溶液加入具塞25ml锥形瓶了，100rpm振荡混合一段时间，4000rpm离心5min，分相。测定下层溶液中芦丁的浓度。

1.2.2 芦丁浓度的测定

对照品溶液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品100mg，置100mL量瓶中，加乙醇70mL，置水浴上微热使溶解，放冷，加水至刻度，摇匀。准确吸取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1mL中含无水芦丁0.1mg)。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液(0.1mg/ml)0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分别置于10mL量瓶中，各加30%乙醇使成5.0mL，各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，充分摇匀，放置6分钟。各精密加入10%硝酸铝溶液0.3mL，充分摇匀，放置6分钟。各加1lmol/L氢氧化钠溶液4.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，放置15分钟，用分光光度计，在510nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。取一定量的下层溶液，测定芦丁的浓度，计算芦丁正向萃取率。

萃取率(%)=(初始芦丁的量-下层溶液中芦丁的量)/初始芦丁的量×100%

2.结果与讨论

2.1 表面活性剂的种类对芦丁萃取率的影响

不同的表面活性剂的表面张力不同，在相同溶剂中形成的反胶束的极性腔大小不同，从而导致萃取效果大不相同。因此，我们首先对表明活性剂的种类进行了筛选。选取了常用的HLB、CTAB、SDS、BRJ35这四种表面活性剂进行对比试验。结果表明，利用SDS和BRJ35构建的反胶束体系，离心后有大量的沉淀，可能是这两种表明活性剂诱导芦丁变性，导致其沉淀，使得萃取率虚高。芦丁是带负电的化合物，因此阳离子表明活性剂CTAB和两性表明活性剂HLB对其都有较好的萃取效果，且CTAB的萃取效果明显要高于HLB。因此我们选择以CTAB作为表面活性剂构建反胶束体系萃取芦丁。

图1 表面活性剂种类的影响

2.2 溶剂的种类对芦丁萃取率的影响

不同的有机溶剂会导致表明活性剂的离子强度不同，从而会影响芦丁进入表面活性剂极性部位的速率及总量。因此，我们考察了正辛烷、异辛烷、正己烷、正庚烷、环己烷这五种溶剂对正向萃取芦丁的影响。如图2所示，当以正己烷作为有机溶剂构建反胶束体系的时候，萃取率最高。

图2 溶剂种类的影响

2.3 表面活性剂的量对蛋白萃取率的影响

表明活性剂总量的增加使得表面活性剂的聚集数增加和反胶束的尺寸增加，有利于目标物质进入反胶束的极性腔中。因此，我们在0.02-0.08g/ml的范围内考察了表明活性剂的影响，结果表明当CTAB的浓度为0.08g/ml的时候，正向萃取率最高。再增加表明活性剂的用量时，离心后，水相会有大量残留的白色物质(未溶解的CTAB)，对后续测量有很大的干扰[3]。且也不利于以后工业化的放大生产，因此我们选择0.08g/ml为最佳条件。

图3 表面活性剂的量的影响

2.4 正己醇对芦丁萃取率的影响

CTAB是单链的表面活性剂，与双链的表面活性剂相比较，其非极性部位更少，往往需要加入正己醇作为助溶剂进行实验[1]。但是本实验发现加入正己醇反而会导致黄酮类物质萃取率的降低。因此，我们选择没有助溶剂的反胶束体系进行实验。

图4 正己醇的影响

2.5 振荡时间对芦丁萃取率的影响

振荡可以强化扩散，使反胶束良好的分散充分，从而促进液态反应物通过固体产物层的有效扩散，增大相界面积和扩散系数[4]。分别考察了振荡时间为3min、5min、7min、9min、11min时，CTAB-已烷反胶束体系对芦丁萃取的影响。结果表明当振荡时间过短或者过长时，离心后的溶液中均会有沉淀存在。当振荡时间在7-9min时，溶液中不存在沉淀。通过计算芦丁的萃取量，确定7min为最佳振荡时间。