QuEChERS法提取-液相色谱-质谱法检测分析制药园区污水中青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素残留方法的建立

(1. 嘉兴市杭环检测科技有限公司，嘉兴 314200；2. 杭州市环境检测科技有限公司，杭州 310000)

随着医药工业的发展，我国各省市均大力发展制药园区，如国家级的浙江省台州市化学原料药基地等，制药园区的发展，提高了当地政府的财政收入、增加了就业岗位、提高了老百姓收入等，但随着偷排、漏排等现象的发生，同时也给当地环境系统造成了一定的污染[1-7]。青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素是最常见的抗生素，制药园区企业生产家数较多，如青霉素生产企业有哈药集团、石药集团等等，其中青霉素钾和青霉素钠有近300个单品规格[8，9]。如果未经处理的污水中含有大量的青霉素等抗生素，会导致水系统、土壤系统等的污染，继而通过食物链的传递，影响人们的身体健康，重者可能导致药物中毒。因此，加强对制药园区污水中青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素等抗生素残留的监测，具有重要的现实意义[10-12]。

赵秋伶，张尤华，于晓艳研究了适体荧光分析法检测养殖废水中四环素类抗生素残留的分析方法[13]，郑璇，张晓岭，李莉，研究了同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法测定城镇污水处理厂废水中5种四环素类抗生素残留的分析方法[14]。现阶段，水体中抗生素残留检测主要以液相色谱法为主，前处理以固相萃取法为主，液相色谱法专属性、灵敏度偏差，对于制药园区污水中基质干扰较大的检测不适用；固相萃取法操作较为复杂，试剂用量大，QuEChERS法是近年来发展起来的新型前处理方法，具有操作简便、处理速度快、试剂用量小等优点。本实验建立了QuEChERS法提取，液相色谱-质谱法检测制药园区污水中的青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素残留的分析方法。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪：shimadzu LC-30A型；三重四级杆串联质谱仪：AB 4500 Trip型；电子天平：十万分之一，AB135-S型；色谱柱：Waters BEH UPLC-C18柱(规格：100×2.1 mm、2.1 μm)；全自动固相萃取仪：AUTO Trace 80型；高速冷冻离心机：H205R型；水浴氮吹仪：H-148型。

1.2 实验材料

青霉素标准溶液：编号：BWN5469-2016，规格：100 μg/mL；洁霉素标准溶液：编号：BWN5484-2016，规格：100 μg/mL；土霉素标准溶液：编号：BWN5109-2016，规格：100 μg/mL；四环素标准溶液：编号：BWN5366-2016，规格：100 μg/mL；庆大霉素标准溶液：编号：1ST7709B-100W，规格：100 μg/mL。

乙腈、丙酮、甲醇：分析纯，500 mL/瓶；甲酸：优级纯，500 mL/瓶；无水硫酸镁、乙酸钠、冰醋酸：分析纯，500 g/瓶；QuEChERS净化包：1 g MgSO4、500 mg PSA和500 mg C18；纯化水。

1.3 色谱、质谱条件

1.3.1色谱条件

柱温：30 ℃；色谱柱：Waters BEH UPLC C18质谱专用柱；流动相A：0.1%甲酸的水溶液，流动相B：甲醇；流速：0.15 mL/min；进样量：10 μL；洗脱模式：梯度洗脱。洗脱表见表1。

表1 洗脱程序

1.3.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：ESI+；离子源温度：560℃；电喷雾电压：4500 V；辅助气压力：72 Psi；气帘气压力：31 Psi；离子传输管温度：350 ℃；碰撞气：氮气；检测模式：多反应监测模式(MRM)。

1.4 溶液制备

1.4.1单一标准储备溶液

取青霉素标准溶液(编号：BWN5469-2016，浓度为100 μg/mL)，移取1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容至标线，摇匀，得青霉素标准储备溶液(浓度：10 μg/mL)；同法配制洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素标准储备溶液。

1.4.2标准曲线溶液

取1.4.1待测物单一标准储备溶液，分别精密移取一定量，置不同的棕色容量瓶中，加甲醇制备每1 mL溶液含有青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素质量分别为0.005、0.01、0.1、1.0、5.0、10.0 μg的标准曲线溶液，加甲醇定容至标线，摇匀。

1.4.3样品溶液1.4.3.1样品预处理

随机采集制药园区污水样品2.0 L，去除表面悬浮物，15 μm滤膜过滤，置棕色广口瓶中，冷藏储存(2～8℃)，24 h内有效。

1.4.3.2样品溶液制备

量取预处理后的水样100 mL，置旋转蒸发仪控制温度45℃，减压浓缩至约5 mL；转移至50 mL离心管中，用25 mL 1%的冰醋酸-乙腈溶液(V∶V=1∶1)清洗旋蒸仪，合并至50 mL离心管中；于离心管中加入乙酸钠2.0 g、硫酸镁5.0 g，涡旋3 min后，冷冻离心5 min(转速控制8000 R/min)，取出；离心后的上清液全部转移至50 mL离心管中，加QuEChERS净化包，涡旋3 min后，冷冻离心8 min(转速控制8000 R/min)；离心后的净化液氮吹至近干(水浴温度为45℃)，加甲醇1.0 mL溶解，涡旋1 min后，0.45 μm 滤膜滤过，即得。

1.4.4 标准测试溶液

取1.4.1青霉素单一标准储备溶液(浓度：10 μg/mL)，移取1.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀；再移取0.2 mL上述溶液，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得青霉素测试溶液(青霉素浓度：200 ng/mL)；同法制备洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素测试溶液。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

制药园区污水中含有较多的化工原料、中间体、药用辅料和成品原料药等有机物，基质成分十分复杂，且干扰成分较多，因此选择合适的前处理方法，对方法的准确度影响较大。常用于污水中有机物的提取方法主要有：凝胶净化色谱法、固相萃取法和QuEChERS净化法等方法[15，16]。凝胶净化色谱法，是采用固定相将待测物保留、洗脱的方式，将污水样品进行富集、净化，净化效果好，但前处理时间长，且仪器价格高，不利于方法的推广；固相萃取法，是采用固相萃取柱富集、净化待测物，操作步骤繁琐、处理时间长，且试剂用量大；QuEChERS净化法是近些年发展起来的新型前处理方法，具有处理速度快、试剂用量少、净化效果好等特点。实验通过比较上述3种方法，对青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素加标浓度均为0.01 μg/mL的样品进行提取。结果比较见表2。

表2 3种前处理方法回收率比较

2.2 质谱MRM方法的建立

取1.4.4标准测试溶液，选择气相色谱-质谱仪全扫描模式，将青霉素测试溶液进样，找到5种待测物母离子；再设置气相色谱-质谱仪扫描模式为产物离子扫描，找到5种待测物母离子对应的子离子，选择丰度较高的2个子离子，其中1个作为定量离子，另一个作为定性离子，对这2个子离子进行去簇电压和碰撞能量的优化，建立青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素多反应监测方法。优化后的MRM方法见表3。

表3 MRM方法参数

2.3 标准曲线、相关系数和检测限考察

取1.4.2标准曲线溶液，每个浓度点测定3次，取平均值，以浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)计算曲线方程，以3倍信号噪音比值计算检测限。结果见表4，典型谱图见图1。

表4 标准曲线、曲线方程、范围和检出限

图1 典型质谱图1.青霉素；2.洁霉素；3.土霉素；4.四环素；5.庆大霉素

2.4 回收率试验

随机采集制药园区污水样品2.0 L，按1.4.3样品溶液方法进行预处理，量取预处理后的水样100 mL，分别加入1.4.1青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素单一标准储备溶液一定量，按1.4.3样品溶液方法进行处理，制备含5种抗生素浓度分别为0.005、0.1和10.0 μg/mL的加标测试溶液，每个浓度测试溶液制备3份；按1.3色谱、质谱条件，分别将上述溶液进样检测，计算回收率和相对标准偏差。结果见表5

表5 回收率试验结果

2.5 方法重复性试验

随机采集制药园区污水样品2.0 L，按1.4.3样品溶液方法进行预处理，量取预处理后的水样100 mL，加入1.4.1青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素单一标准储备溶液一定量，按1.4.3样品溶液方法进行处理，制备含5种抗生素浓度均为0.01 μg/mL的重复性检查溶液，同法共制备6份重复性检查溶液；按1.3色谱、质谱条件，分别将上述溶液进样检测，计算5种抗生素重复性RSD。结果，青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素重复性RSD分别为：3.25%、2.99%、4.02%、3.61%和3.54%。表明，方法具有良好的重复性。

3 结论

实验建立了采用QuEChERS净化法提取、净化制药园区污水中的青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素5种抗生素，液相色谱-质谱法定量、定性检测的分析方法。针对前处理方法和检测方法进行了讨论，确定采用QuEChERS净化法作为前处理方法，液相色谱-质谱法作为检测方法；对质谱的多反应监测方法进行了优化，优化了碰撞能量和去簇电压等；对方法的线性范围、加标回收、重复性等进行了系统的考察。实验结果证明，此方法操作步骤简单、速度快、检测结果准确，适用于制药园区污水中极微量青霉素、洁霉素、土霉素、四环素和庆大霉素残留的监测。