葛根素标准样品的研制

(1.北京市理化分析测试中心，有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京市科学技术研究院分析测试技术重点实验室，北京 100089；2.中国标准化研究院，北京 100191)

葛为多年生豆科缠绕藤本植物，侧蔓和须根多，但块根深生，呈纺锤形或长棒形，表皮为淡黄色，有皱褶，是主要食用和药用部分。葛根为野葛(Pueraria Lobata(Willd.) Ohwi)或粉葛(P. thomsomi Benth)的干燥根，含有异黄酮类、三萜类、芳香类等活性成分。其中异黄酮类化合物是葛根的主要化学成分。葛根味甘、辛，性凉，归肺、胃经，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻等功效[1]，被广泛用于保护心脑血管[2-4]、治疗感冒[5]、Ⅱ型糖尿病[6]、腹泻等中药复方制剂中，用量极大，是制剂的重要成分。其中葛根素是葛属植物的特有成分，亦是主要有效成分，具有扩张冠状动脉血管，降低血脂，增强心肌收缩力，降低血压，防治高血压头晕、头痛、颈项疼痛[7-12]等功效。

市场上葛根相关的产品种类繁多，其中葛根素作为葛根主要的化学成分，其含量的检测需要该标准样品作为检测对照；同时，在葛根相关活性研究和产品开发中，葛根素也是重要的研究对象，因此迫切需要开展该标准样品的研制工作。本研究采用高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)技术制备葛根素，通过紫外吸收光谱(ultraviolet absorption spectrometry，UV)、红外光谱(infrared spectroscopy，IR)、质谱(mass spectrometry，MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)波谱等方法进行结构鉴定，并开展均匀性检验、稳定性检验、定值研究，最终得到纯度大于98%、扩展不确定度小于1%的葛根素标准样品。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

KQ-250E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TBE-300B半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；LC-20高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；RE-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；ALPHR1-2冷冻干燥机(德国Marin Christ公司)；Spectrum400傅立叶变换红外-近红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)；1100 Series LC/MSD SL(美国Agilent公司)，超导核磁共振谱仪(德国Bruker公司)。

乙酸乙酯，甲醇，正丁醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；葛根提取物(湖南长沙远航生物制品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 葛根素样品制备与分装

HSCCC溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3，v/v)，转速900 r/min，流速1.5 mL/min，分离温度25℃，检测波长254 nm。根据HSCCC图谱收集目标化合物，旋转蒸发去除溶剂，冷冻干燥后得到高纯度葛根素样品。

将葛根素样品采用2 mL棕色样品瓶进行分装。分装是在相对独立和洁净空间进行的，以每瓶10 mg分装，用十万分之一天平称量，样品共100 瓶，以1～100号计。分装好的样品瓶放在4℃冰箱中长期保存。

1.2.2 纯度分析

配制浓度为0.5 mg/mL的葛根素样品溶液，采用HPLC峰面积归一法对葛根素进行纯度分析。色谱柱为Wondasil C18(5 μm, 150×4.6 mm) ；流动相∶乙腈∶水=12∶88；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；运行时间：30 min。

1.2.3 结构确证

采用UV、IR、MS、NMR进行结构确证。UV分析条件：甲醇作为溶剂，浓度为0.1 mg/mL，扫描范围200～400 nm；IR分析条件：KBr压片法，扫描范围400～4000 cm-1。MS分析条件：正、负两种离子模式，锥孔气流速40 L/min，毛细管电压3.0 kV，脱溶剂温度320℃，质量扫描范围m/z150～1000。NMR分析条件：溶剂为氘代丙酮加重水，采集13C-NMR和1H-NMR谱图。

1.2.4 均匀性、稳定性、定值研究

依据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则(3)标准样品：定值的一般原则和统计方法》[13]开展均匀性检验、稳定性检验、定值研究工作。均匀性：采用方差分析法进行纯度均匀性检验，判断葛根素的均匀性是否合格。稳定性：将葛根素样品避光贮存于4℃，开展12个月长期稳定性的研究。采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，预测葛根素的稳定性变化。定值：采用多个实验室协作试验的联合定值方式，分别对随机抽取8个样品进行检测，对所采集的测定结果采用格拉布斯(Grubbs)检验法进行检验，计算葛根素标准样品的标准值和不确定度。

2 结果与分析

2.1 葛根素制备及纯度分析

采用HSCCC乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3，v/v)溶剂体系分离纯化得到高纯度葛根素样品(图1)，采用HPLC对葛根提取物和分离所得单体进行洗脱，254 nm检测波长下，应用峰面积归一法计算纯度值，分离所得单体葛根素的纯度为99.53%。(图2)

图1 葛根素HSCCC图

图2 葛根素HPLC图A.葛根提取物；B.分离所得单体

2.2 结构确证

采用UV、 IR、 MS、NMR对葛根素进行结构鉴定。UV最大吸收波长为250 nm(图3)； IR吸收峰(图4)：3240(-O-H)，1634(-C=O)，1515，1446(Ar)，1260，1212，1178，1082(醚-C-O)。通过ESI-MS正负离子模式扫描(图5)可得：[M+Na]+=439.2，[M-H]-=415.1，故测定的相对分子质量为416。1H-NMR和13C-NMR测试结果见图6，通过对数据进行归属(表1、表2)。与文献[14,15]进行比较，确定该样品为葛根素。

图3 葛根素紫外吸收光谱图

图4 葛根素红外光谱图

图5 葛根素质谱图A.正离子模式；B.负离子模式下

图6 葛根素核磁共振图谱A.1H-NMR；B. 13C-NMR

H的位置测定值文献值[15]2832882857951798669997022ˊ73917403ˊ68226835ˊ68226836ˊ73917401ˊˊ4829490

表2 13C-NMR测试数据

续表2

2.3 均匀性检验

由于所制备的样品单元数都小于100，根据随机数表，分别抽取10瓶样品进行均匀性检验。其中葛根素瓶号为42、9、67、89、53、63、32、75、36、60；每瓶样品各称3份，每份1.0 mg按照1.2.2纯度分析方法进行HPLC分析，计算其纯度。采用方差分析法进行检验，对其均匀性做出判断。结果见表3。

表3 根素样品均匀性检验结果

2.4 稳定性检验

将葛根素样品于4℃冰箱冷藏避光保存，以1年为期，对制备的葛根素样品每3个月取样，按1.2.2纯度分析方法，峰面积归一化法进行纯度计算，每份试样平行测试3次，采用t检验对数据进行分析，稳定性检验结果见表4。

表4 稳定性检验结果

采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，以此对标准样品的稳定性变化进行预测。斜率可用下式计算：

直线上的点的标准偏差可由下式计算：

式中稳定性测量次数n=3。

取其平方根s=0.276%，与斜率相关的不确定度用下式计算：

自由度为n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布t因子等于3.128，由于|b1|

2.5 定值

对联合定值的8家实验室所采集的测定结果，采用Grubbs检验法进行检验，未发现异常值。经过数据统计，计算得出葛根素样品的标准值和不确定度。不同实验室检测和方差分析结果见表5、表6。

表5 不同实验室检测结果

表6 不同实验室方差分析结果

总平均值由下式计算：

总平均值的不确定度等于：

=7.43×10-5,

式中，实验室内测量次数n=6，实验室数量p=8，

在置信概率为95% 时，k=2，则扩展不确定度UCRM=2uCRM=0.70%。

3 结论

针对我国尚无葛根素国家实物标准样品的现状，开展了葛根素标准样品的研制工作，成功的建立了葛根素样品的制备方法。并依据GB/T 15000标准样品工作导则，对制备得到的葛根素样品进行均匀性检验、稳定性检验及定值研究，最终申报获批成为国家实物标准样品。

葛根素标准样品的标准值为99.51%，扩展不确定度(95%置信区间)为0.70%。该标准样品符合GB/T 15000标准样品工作导则要求，填补了国内该领域研究的空白。葛根素标准样品不仅可以满足葛根及相关产品分析检测、质量控制工作的需求，同时，也为检测结果的准确性、可比性，以及溯源性提供了技术支撑。

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