超高效液相色谱-串联质谱法同时检测动物源性食品中残留的35种β-受体激动剂和11种β-受体阻断剂

(北京市食品安全监控和风险评估中心，北京 100041)

β-受体激动剂类，又称β-肾上腺素受体激动剂(β-adrenoceptor agonisit)，是一类可与β-肾上腺素受体结合，并形成刺激效应的药物。β-受体激动剂通过选择性的与细胞膜上的受体结合，发挥生理活性作用。在临床医疗上，β-受体激动剂主要应用于通过扩张平滑肌治疗由哮喘、阻塞性肺炎引起的支气管痉挛。在畜牧业上，β-受体激动剂则被用作一种瘦肉增长剂。β-受体激动剂可使多种动物(猪、牛、羊等畜禽动物)体内营养成分由脂肪组织向肌肉组织转移，这种作用称为“再分配效应”，其结果是体内的脂肪分解代谢增强，蛋白质合成增加，能显著增重并提高饲料转化率，明显改善肉质，具有诱人的经济效益。这种再分配效应在上世纪80年代初由美国科学家发现，并推广应用于畜牧养殖中，但是该类药物会在动物体内造成严重的残留，人食用了这类动物源性食品(特别是内脏)后，药物残留随食物链进入人体，引起中毒反应，主要表现为肌肉震颤、口干、头痛头晕、心动过速、手抖，对于高血压、心脏病患者危害更大，甚至危及生命。我国农业部连续出台176号[1]、193号、235号、1519号公告，严令禁止包括“瘦肉精”克仑特罗在内的十余种β-受体激动剂在畜牧养殖中使用，并规定该类物质不得在动物源性食品中检出。

β-受体阻断剂(β-adrenoceptor blockers)与激动剂相似也是作用于β-受体，是能选择性的与β-肾上腺素受体结合，从而拮抗神经传递质和儿茶酚胺对β-受体激动作用的一类物质。在临床上，有抗高血压、抗心肌缺血、通过抑制肾素释放而发挥一定的阻断肾素血管紧张素醛固酮系统作用、改善心脏功能和增加左心室射血分数、抗心律失常等。在过度使用的情况下，可减慢心率, ,严重心动过缓和房室传导阻滞, 产生疲劳、头痛、睡眠紊乱、失眠、多梦和压抑等严重情况。虽然β-受体阻断剂被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡(通过降低心率，来延缓刺激)，但β-阻断剂在动物源性食品中违禁使用的研究和报道几乎没有。由于这类药物往往是在动物屠宰前的数小时内被注射使用的，因此该类药物相对其他兽药会造成更高的残留量和更大的风险危害。长期摄入会造成焦虑、头痛等精神症状，还有可能造成药物依赖性。此类风险化合物目前的研究依然较少。另外β-受体激动剂和β-受体阻断剂也都是国际奥林匹克委员会禁止使用的兴奋剂类药物。

目前, 国内外报道的动物源性食品中β-受体激动剂和β-受体阻断剂的检测的确证方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[2-6]、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)[ 7-13]等，基本上是单独方法检测，很难满足对多种该类药物残留的同时检测。本方法针对35种β-受体激动剂和11种β-受体阻断剂建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高、检出限低的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法。

1 实验部分

1.1 仪器

UPLC-TQS超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪，美国Waters公司； Milli-Q纯水仪，美国Millipore公司；3K15高速冷冻离心机，美国Sigma公司。

1.2 试剂

沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗(西马特罗)、塞布特罗(西布特罗)、莱克多巴胺、克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗、溴代克仑特罗、菲诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、福莫特罗、异丙喘宁(奥西那林)、丙卡特罗、克仑塞罗、克仑丙罗(克仑普罗)、利妥特灵(利托君)、克仑潘特、异克仑潘特、苯乙醇胺A、齐帕特罗、班布特罗、沙美特罗、瑞普特罗、维兰特罗、茚达特罗、阿福特罗、羟甲基克仑特罗、clenhexerol、吡布特罗、可尔特罗、拉贝洛尔、倍他洛尔、喷布洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、阿罗洛尔、索他洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、卡维他洛、美托洛尔、西马特罗D7、克仑丙罗D7、莱克多巴胺D5、马布特罗D9、马贲特罗D11、沙丁胺醇D3、克仑特罗D9、沙丁胺醇D11、西布特罗D9、苯乙醇胺A-D3均购自德国Dr.Ehrenstofer GmbH公司；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(100000Unit/mL)购自默克公司；乙酸铵购自Sigma-Aldrich公司。);固相萃取柱(Su-pelco Supel MIP beta-receptors25mg/10mL,Sigma-Aldrich 公司)；乙酸、高氯酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、氨水均为分析纯;所用水为超纯水。

1.3 混合标准工作液的配制

精密称定适量的上述35种β-受体激动剂和11种β-受体阻断剂对照品, 用甲醇配制成1000mg/L的标准储备液，保存于-20℃冰箱内，有效期为半年。

1.4 样品前处理

1.4.1样品提取

猪肉及其制品粉碎，称取粉碎均匀的样品2.00g于50mL聚四氟乙烯离心管内，加入10ng内标标准物，加入10mL pH=5.20.2mol/L的乙酸铵-乙酸缓冲液，充分涡旋均质后，加入50μL β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37℃下200rpm震荡酶解16小时。取出后冷却至室温，涡旋后于10000rpm下离心10min，取5mL上清液于一干净的离心管中，加入5mL0.1mol/L高氯酸溶液，混合均匀后用高氯酸调节pH至1.0，涡旋后于10000rpm下离心10min，取出全部上清液至一干净离心管中，用10mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为11.0，加入10mL饱和氯化钠及10mL异丙醇/乙酸乙酯(5∶5)溶液，充分涡旋提取5min，于10000rpm下离心，取上层有机相清液在40℃下氮气吹干。加入5mL 酶解用乙酸铵缓冲液，充分溶解残渣后上柱。

1.4.2样品净化

取25mg10mL固相萃取柱用3mL甲醇，3mL水活化，溶解液全部上柱，控制流速在0.5滴/s，依次用3mL水，3mL60%的甲醇水溶液，1mL甲醇淋洗MIP柱，真空抽干后，用2mL含1%甲酸的甲醇溶液洗脱，控制流速在0.5滴/s，收集洗脱液于40℃下吹干，用1mL5%甲醇和95%5mmol/L乙酸铵0.1%甲酸水溶液溶解，过0.2μm聚四氟乙烯膜，供上机测定。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件

液相色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm*2.1mm,1.7μm)；流动相：甲醇(A)和5mmol/L乙酸铵0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱条件如下表；流速：0.40mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL(表1)。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱条件

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式，毛细管电压2.80kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度400℃，脱溶剂气流量800L/h，锥孔气流量150L/h，雾化气压力7.0bar。碰撞气流量0.17mL/min。46种化合物及的10种内标的质谱参数见表2，总离子流图见图1。

表2 β-受体激动剂和阻断剂定量检测质谱参数

续表2

续表2

续表2

图1 β-受体激动剂和阻断剂定量检测总离子流图

2 结果与讨论

2.1 样品前处理过程的优化

2.1.1 萃取溶剂的选择

多组分化合物的同步检测要求样品前处理方法必须能够兼顾大部分目标化合物的回收率。在酶解之后，β-受体化合物游离于缓冲液之中，通过调节pH使环境呈酸性促进了化合物的电离平衡向离子化方向移动，更多的目标化合物以离子的形式存在于水相当中，而干扰物的蛋白质则由于等电点沉淀或进一步的酸解而沉淀下来，在冷冻离心的作用下，伴随脂肪一起被除去。此时再将提取液调节至pH值呈碱性，使目标化合物的电离平衡向分子方向移动，目标化合物以不解离的分子状态被不互溶的有机溶剂反萃取，水相中留下了pKa值不相同的其他可溶杂质。从提取初净化的策略中可以看出，反萃取所使用的有机试剂的组成和配比是这一步骤中影响回收率的关键点。因此对萃取溶剂进行了优化，主要考察了不同比例乙酸乙酯、异丙醇、乙腈的萃取效率。结果表明，乙腈相对于饱和盐溶液具有互溶性，两相分配不佳。46种化合物对乙酸乙酯和异丙醇的分配各异，采取不同配比时，所得到的萃取效率也各不相同。在兼顾所有化合物的原则下，最终确定使用乙酸乙酯∶异丙醇=5∶5进行萃取(图2)。

图2 不同萃取溶剂条件下46种β-受体激动剂和阻断剂平均回收率情况

2.1.2 净化条件的选择

在多组分检测方法建立的过程中要格外注意净化步骤的选择，首先要保证各化合物的回收率良好，在此前提下尽可能的除去杂质提高目标化合物的相应灵敏度。本项目在方法建立过程中研究对比了常用的几种固相萃取净化柱以及新型的分子印迹柱，具体选择的对比型号如下：Waters Sep-pak C18 500mg/6mL，极性分配固相萃取；Waters Oasis HLB 150mg/6mL，亲水亲脂分配固相萃取；Waters Oasis MCX 150mg/6mL，混合强阳离子固相萃取；Dikma ProElut PXC 150mg/6mL，混合强阳离子固相萃取；Supelco Supel MIP beta-receptors 25mg/10mL，分子印迹固相萃取。实验对比了以上5种净化柱的净化效率，以回收率作为净化效果的参考，实验结果表明，在C18柱上，多数化合物回收率小于70%，这可能是由于固相萃取柱柱效较低有关。在HLB柱上，由于依然是共价键结合分配机理，故回收率也不理想。MCX和PXC均为苯磺酸型强阳离子交换机理，国家标准中也多使用该类型的固相萃取柱，从实验的结果看，能够达到需要的净化效果，但对于某些β-受体阻断剂回收率不佳。MIP柱具备了特异性的β-受体结构，能够特异性的结合β-受体激动剂和阻断剂，这使得MIP柱净化具有高度专一性和较好的回收率[14-20]。见图3。

图3 不同固相萃取柱净化平均回收率情况

2.1.3 样品基质效应的消除

基质效应是指当色谱分离时基质中存在的干扰物与待测目标化合物共洗脱从而改变了待测组分的离子化效率，所引起信号的提高或抑制。当基质效应影响较大时会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性。本研究的样品基质主要是动物肌肉、肝脏，基质成分比较复杂，基质效应明显，因此为了最大限度消除基质效应干扰，本实验采用基质加标法定量。在空白样品基质中加入标准溶液系列进行相同的前处理步骤，得到基质加标标准曲线系列，可使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化环境，从而消除基质效应。同时采用内标矫正，更增加定量的准确度。

2.2 色谱-质谱条件的优化

采用超高效液相色谱/串联四极杆质谱对46种β-受体激动剂和阻断剂进行定量检测，由于这些化合物结构较为相似，化学性质差异不大，因此在色谱柱上的保留区别不大，更需要精细的条件将其分离，选用了waters ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)。由于电喷雾质谱在电离时会有流动相组成中的各种离子存在，进而会影响分析物的离子化效率。对于反相C18柱，在流动相中加入低浓度的酸可以极大改善弱碱性化合物的峰型，同时加入低浓度缓冲盐可以增加离子化效率，提高响应，因此选择在水相流动相中加入5mmol/L乙酸铵以及0.1%的甲酸。

质谱条件的确定是使用IntelliStart软件自动完成，对定量定性离子对、锥孔电压、碰撞电压均进行了优化。为了减少质谱同一时间段采集离子的数目(会造成扫描时间过快，降低灵敏度)，根据化合物在液相色谱上保留时间的不同，对质谱方法进行了分段处理，以保证每个色谱峰均具有足够的扫描次数，能够完整的得到化合物的扫描数据。

2.3 定量检测技术的方法验证

2.3.1 标准曲线和检出限

根据46种β-受体激动剂和阻断剂基质加标标准曲线得到的数据，以峰面积-浓度绘制标准曲线。以得到信号为3倍信噪比的每种目标化合物的样品浓度为准，即为该化合物的方法检出限(表3)。

表3 β-受体激动剂和阻断剂的标准曲线方程、相关系数、线性范围和检出限

续表3

2.3.2 方法的回收率和精密度

分别取动物肌肉、肝脏空白样品，添加低、中、高3个不同浓度水平的46种β-受体激动剂和阻断剂混合标准溶液，进行前处理，测定目标化合物。每个浓度水平进行6次试验，结果见表4，46种化合物的平均回收率为62.31～110.52%，相对标准偏差为1.03～13.33%。

表4 β-受体激动剂和阻断剂的回收率和相对标准偏差

续表4

续表4

3 结论

通过对方法检测条件的优化，建立了动物肌肉、肝脏中β-受体激动剂和阻断剂的快速、高效前处理方法，结合超高效液相色谱/串联四极杆质谱仪，实现了复杂样品基质中46种β-受体激动剂和阻断剂的高灵敏度、高特异性的定量检测方法。该方法快速、灵敏、准确，稳定，适用于食品安全突发事件的快速应急处置工作。

[1]农业部第176号公告. 禁止在饲料和动物饮水中使用的物质[S].

[2]朱坚,李波,方晓明,等.气相色谱-质谱法测定肝、肾和肉中β2 -受体激动剂残留量[J].质谱学报,2004,23(增刊)：245-247.

[3]孔莹,邱月明,李鹏,沈建忠。固相萃取/气相色谱-质谱同时测定猪肉中4种β-激动剂类药物残留量[J].分析测试学报，2006,25(2)：63-66.

[4]孟娟,邵兵,吴国华, 薛颖.气相色谱-质谱法同时测定动物性食品中8种β-兴奋剂的残留量[J].中国卫生检验杂志，2005,15(6)：641-643.

[5]朱坚, 杨景贤, 李波, 等. 气相色谱-质谱法测定肝、肾和肉中β-受体激动剂残留量[J]. 分析测试学报, 2004, 23(9): 223-225.

[6]王培龙, 范理, 苏晓鸥, 等. 分子印迹固相萃取-气相色谱-质谱法测定猪尿中4 种伊受体激动剂[J]. 分析化学, 2012, 40(3): 470-473. .

[7]戴华,袁智能,黄志强,陈新焕。饲料中盐酸克伦特罗、沙丁胺醇高效液相色谱测定[J].分析测试学报，2003,22(3)：57-59.

[8]韩婉清，吴楚森，吴玉銮，等。超高效液相色谱-串联质谱测定动物肌肉组织中32 种β-激动剂、β-阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留[J].分析化学，2016,44(2)：289-296. DOI: 10。11895 /j.issn.0253-3820.150830.

[9]刘佳，谢云峰，任丹丹，等。反相液相色谱-串联质谱法检测猪肝中26 种β2 - 受体激动剂类药物残留[J].分析化学，2014,42(10)；1486-1492. DOI: 10.11895 /j. issn.0253-3820.140457.

[10] 张鸿伟,许辉,高建国,等。超快速液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱同时检测猪组织中9种β-受体阻断剂残留[J].色谱，2014,32(6)：573-581.

10.3724/SP.J.1123.2014.02014.

[11] Shao Bing, Jia Xiaofei, Zhang Jing, et al. Multi-residual analysis of 16β-agonists in pig liver, kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2009, 114: 1115-1121.

[12] Carrasquilla M H. External contamination of bovine hair withβ-agonist compounds: 2 evaluation of decontamination strategies[J].Journal of Chromatography B, 2002, 767: 235-243.

[13]金雁, 姚家彪, 姜莉, 等. 高效液相色谱法同时测定禽肉中的克伦特罗和沙丁胺醇[J]. 现代仪器, 2005(5): 34-36.

[14]许辉,张鸿伟,张罡,王凤美. 动物源食品中β受体阻断剂残留量测定的不确定度评定[J].质谱学报,2015,36(2):185-192. DOI:10.7538/zpxb.youxian.2014.0062.

[15]张毅, 岳振峰, 蓝芳, 等. 分散固相萃取净化与液相色谱/串联质谱法测定牛奶中8 类禁用药物残留[J]. 分析化学, 2012, 40(5): 724-729.

[16] 宋迎春, 谭洪涛. 固相萃取及其在食品分析中的应用[J].江西医学检验, 2005, 23(6): 583-585.

[17] Antignac J P, Marchand P, BIZEC B L, et al. Identification of ractopamine residues in tissue and urine samples at ultra-trace level using liquid chromatography-positive electrospray tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2002, 774(1): 59-66.

[18]孙雷,张骊,朱永林,王树槐,等. 超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中残留的9种β-受体激动剂[J].色谱，2008,26(6)；709-713.

[19]吴平谷, 陈慧华, 王强, 等. 气相色谱-质谱法测定动物组织中残留的10种β-兴奋剂[J]. 色谱, 2008, 26(1): 39-42.

[20]李俊锁, 邱月明, 王超. 兽药残留分析[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2002: 365.