过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）色谱模型的构建及在小分子肽筛选中的应用*

（西安培华学院，陕西 西安 710125）

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）最早是由英国科学家在1990年发现的[1]。PPAR作为核受体的其中一种，主要分为PPARγ1和PPARγ2两种类型。有研究发现其在肝脏中大量存在，在一定程度上可以起到保护肝脏的作用[2-3]。PPARγ2在分子表达式中相对于PPARγ1多一部分的氨基酸。一般情况下，PPAR主要由6个主区域和4个功能区域组成[4-6]。其中6个主区域主要有A-F区域组成。PPARγ受体中间区域是其DNA的分子结合区（C区）。E/F区是PPARγ受体的配体结合区域；而氨基酸部分是其主要的调节区域；D区域在其受体中主要起到连接的作用，它能够与其他的因子结合从而改变PPARγ受体的性能[7-8]。

PPAR是核受体中的主要一部分，其生物学特性相当复杂。目前针对PPARγ受体的研究主要集中在各种疾病：糖尿病、肿瘤等的治疗效果[9-11]。本文主要分析PPAR受体色谱模型的构建，同时结合小分子肽的特性，研究PPAR受体色谱模型在小分子肽筛选中的应用。

1 过氧化物酶增殖物激活受体

1.1 PPAR的结构及配体

PPARγ受体的配体有两类：天然和合成的配体[12]。详细划分可以将天然配体分为：必要的脂肪酸、oxLDL及其氧化物等。而合成配体可以分为：糖尿病的靶向药物部分的非甾性抗炎药，如平常使用最广泛的布洛芬。

1.2 PPAR的功能

PPARγ针对人体的脂肪组织有着相应的特异性能，脂肪组织在分化时其能够起到一定的作用。有学者就针对PPARγ在人体脂肪细胞中的具体作用进行过相关的研究[13]。研究结果表明，PPARγ在脂肪代谢过程中参与了重要的反应，其对脂肪组织的转化和合成有着一定的辅助作用。研究还发现，PPARγ针对人体肝脏内的脂肪合成和脂肪的积累都起到重要的作用。

同时，PPARγ在现代糖尿病的靶向治疗中也能起到一定的效果。通过特定手段合成的PPARγ激动剂能够降低人体的血脂和血糖的含量，在一定程度上提高胰岛素的敏感性。PPARγ主要的作用机制表现在：（1）针对脂肪组织的分泌状况进行适时的调节；（2）在一定程度上增强胰岛素的传递功能。

2 PPAR生物色谱法

PPAR生物色谱法的原理是将PPARγ受体通过特定的方式固定在载体上，选用色谱分析技术针对PPARγ受体进行筛选[14]。通过筛选的载体的特性来判断PPARγ受体的结合能力。此方法相较于传统的方法主要优点表现在其筛选速度快、方便。

PPAR生物色谱法中常常需要用到一定的受体。硅胶由于其表面积大、机械强度高成为了生物色谱法中的主要受体。但同时，由于硅胶表面的基团性质不稳定，会对生物色谱筛选的结果产生一定的误差和影响。针对此问题，有学者对其进行了研究，研究发现：改良的细胞膜色谱法能够具有一定的生物亲和性，针对PPAR受体色谱的问题可以将细胞膜和其表面的硅胶进行融合制成特定的色谱柱。

3 PPAR受体色谱模型的构建

在本文实验中，首先挑选合适的单菌落置于对应的液体培养基中，控制温度为38℃，对上述液体培养液进行振荡。静置后取上述的培养液1mL放置于无菌的试管中。将实验设备的转数设置为6000r/mp，离心操作6min，最后在无菌的试管中加入150μL的CaCl2溶液。

3.1 实验

在上述静置的液体中吸取2μL的溶液。在转移的过程中保证液体能吸入到试管中，实验才能顺利完成。其后，将上述静置的液体放置于冰中6min，加入预先准备好的培养基（LB）。观察单菌落的成长状况。

将菌体置于Ni-Native-0的溶液中，通过超声的作用制得上清液，离心操作收集上清，然后将其保存在-20℃的环境中。将上述溶液中的乙醇液体倒出，并在其中加入10mL的Ni-Native-0液体以达到平衡的作用。最终制得的分离胶和浓缩胶的配置情况见下表1。

表1 分离胶和浓缩胶的配制方案Table 1 Formulation of separation gel and concentrated gel

将上述配置完成的液体样本进行混合，然后将其放入事先准备好的热水中加热，最后取上部的清澈样本。按照表1所示的方案制取25mL的分离胶，将分离胶注入到上述清澈样本中。静置，待分离胶凝固后，除去上部的液体，并注入上述制得的15mL浓缩胶。直至得到的色带清晰可见为止。

3.2 实验结果

通过上述的实验操作可以发现，具体的hPPARγ-LBD重组质粒的转化情况如图1所示。通过图1可以发现，培养液中出现了单一的菌落，同时菌落的生长状况良好。此现象也反应了PPAR色谱模型的成功构建。

图1 hPPARγ-LBD重组质粒的转化Fig.1 Transformation of hPPARγ-LBD recombinant plasmid

上述实验制得的蛋白通过特定的Ni柱后，通过特定条件下的洗脱可以制得相应的如图2所示的SDS-PAGE分析提取纯化的hPPARγ-LBD。从图2中可以看出,最终得到的溶液分层明晰。通过相应的色谱分析可知,此溶液最终形成的蛋白含量最高，几乎没有其他蛋白的掺杂。本实验中选取了菌落的特征作为相应的色谱构建的表达形式。其主要目标是能够通过蛋白的分析得到PPAR色谱模型。

4 PPAR受体色谱模型在小分子肽筛 选中的应用

小分子肽在筛选的过程中主要以下几种方法：噬菌体展示肽、降解蛋白质法、多肽结构法等[15]。上述小分子肽筛选技术中，我们平常使用最多的是噬菌体展示肽技术和组合肽技术。组合肽技术是1991年首次提出，其主要的作用机理是将天然、非天然的氨基酸成分进行合成。然后根据具体的要求进行合成，具体的可以合成氨基酸不等的肽链。此方法的优点是筛选速度快，能够在短时间内对数以万种的肽键进行一一对应的筛选。除此之外噬菌体展示肽也是目前市面上小分子肽筛选中比较普遍的方法。其主要的缺点在于通过噬菌体展示肽筛选得到的肽链性能不稳定，不能得到理想的肽链。

针对PPAR受体色谱模型在小分子肽筛选中的应用,国内外有过相应的研究。其主要集中在通过化学肽技术与受体色谱融合技术筛选得到相应的小分子肽。研究表明,小分子肽在现实生活中的肿瘤靶向治疗领域内有着一定的应用前景。但目前还缺乏有力的证据能证明其能够有效治疗癌症的成功案例。针对小分子肽筛选技术的研究还需要进一步的深入和发展。

5 结论

本文通过对PPAR的结构及配体进行分析，了解了其主要的功能。同时结合生物色谱法分析了PPAR受体色谱的构建过程。实验结果表明,本文选择的菌落特性能够很好地识别PPARγ受体，并且能够从特定的混合液体中筛选出PPARγ受体的成分。同时，该PPAR色谱模型能够在小分子肽筛选中取得一定的研究进展，为接下来学者的研究提供相应的参考价值。