山楂苦荞醋发酵过程中活性成分及风味物质与抗氧化活性的相关性

陈旭峰，王超宇，魏莎莎，朱 丹，郎繁繁，张晓宇，许 女*

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.食醋发酵科学与工程山西省重点实验室，山西 太原 030400；3.山西紫林醋业股份有限公司，山西 太原 030400）

我国是山楂、苦荞的生产大国[1-2]。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）营养丰富，可供食用的同时还可作为一种常用的消食药。山楂含有多种有机酸[3]，如山楂酸、柠檬酸，是促进消化的主要成分[4]；还有丰富的黄酮类物质、氨基酸及矿物质，食用山楂可以帮助人体改善循环，降低血压、减少心血管类疾发病率[5-6]。

苦荞（Fagopyrum tataricum）也可药食两用，我国古代便有苦荞可治病防病的记录[7]。苦荞含有的营养素较多，据研究，苦荞中有多种氨基酸和微量元素，有一定保健价值[8]。如苦荞中含有其他谷物没有的芦丁，可以帮助舒张血管，抵抗炎症，促进伤口愈合，降“三高”；含有的维生素E有较强的抗氧化能力，可以帮助清除过剩自由基；富含的黄酮类物质具有抗氧化、抗炎、改善机体免疫力的功能[9]；含有的粗纤维可清洁消化壁，促进肠胃运动，增强消化功能，帮助人体排出有毒物质，起到预防疾病的作用[10]。

山楂产品种类丰富，可以通过干制、发酵，做成山楂酒、罐头等。苦荞产品的种类多种多样，如苦荞沙琪玛、苦荞饼干、苦荞酒等[11]。果粮复合醋是采用果实或果酒为原料，和粮食一起经过微生物发酵，酿造而成。具有独特的口味、较高的营养价值以及一定的保健功能。适当饮用果粮复合醋可以帮助人体代谢、美容养肤、减缓细胞衰老，其中含有的有机酸、氨基酸等物质具有预防高血压、心脏病等作用[12]。目前关于果粮复合醋的研究越来越多，张海玲等[13]将山药和梨混合酿造出山药-梨复合醋，通过探究得出山药汁与梨汁最佳配比为1∶3（V/V），并采用单因素试验与正交试验对其发酵工艺进行了优化。许艳俊[14]将苹果、山楂、高粱复合，酿造出苹果山楂果粮醋，优化了该复合醋发酵工艺，且苹果山楂果粮醋的风味物质种类及抗氧化活性优于单一原料醋。

本实验对山楂苦荞果粮复合醋酿造生产过程中的总多酚、总黄酮含量、挥发性香气成分含量及羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率、亚铁离子螯合率进行测定，通过相关性分析，进一步了解山楂苦荞醋总多酚、总黄酮、挥发性香气物质的变化及其与抗氧化活性的变化规律和特点，以期为山楂苦荞果粮复合醋产品的研究开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

山楂、苦荞、白砂糖：市售；酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌：均保存于山西农业大学食品科学与工程学院生物工程实验室。

1.1.2 试剂

果胶酶（酶活力≥2 500 U/g）、α-淀粉酶，糖化酶（酶活力≥2 000 U/g）：沧州夏盛酶生物技术有限公司；无水芦丁（色谱纯）、DPPH（分析纯）、福林试剂（生化试剂）：北京百奥莱博科技有限公司；氢氧化钠、三氯乙酸、亚硝酸钠、硝酸铝、碳酸钠（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar,PDA）培养基、醋酸菌培养基、MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；722型可见分光光度计：浙江赛德仪器设备有限公司；Trace1300气相色谱仪、TraceISQ质谱分析仪：赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山楂苦荞醋的制备工艺流程与操作要点[15-16]

菌悬液制备：将酿酒酵母接种于1 mL PDA培养基中，30 ℃培养12 h进行活化，按接种量5%（V/V）接种于PDA培养基中，30 ℃培养至OD600nm值为1，8 000 r/min离心10 min，用0.85%生理盐水清洗菌泥，8 000 r/min二次离心10 min，离心后用与培养基等体积0.85%生理盐水将菌泥重悬备用；将巴氏醋杆菌接种于1 mL醋酸菌培养基中，30 ℃、150 r/min培养12 h进行活化，按接种量5%（V/V）接种于醋酸菌培养基中，30 ℃、150 r/min培养至OD600nm值为1，后续操作同酿酒酵母；将植物乳杆菌接种于1 mL MRS培养基中，37 ℃培养12 h进行活化，按接种量5%（V/V）接种于MRS培养基中，后续操作同酿酒酵母菌。

原料预处理：将去核后的山楂切块，加入4倍水，加热至90 ℃进行软化10 min，降温后用榨汁机打浆，加入0.3%的果胶酶，45 ℃水浴酶解2～3 h，备用；将苦荞用粉碎机粉粹为粉末状，加入6倍水，加热至85～95 ℃，不断搅拌，进行糊化1～2 h后加入1.5%～4.5%α-淀粉酶，85～95 ℃条件下酶解至滴加碘液不变蓝，降温至60 ℃，加入0.3%糖化酶酶解1～3 h，备用。将酶解好的山楂浆与苦荞浆按照1∶2（V/V）的比例混合，用白砂糖调糖度至11～13°Bx，60 ℃水浴30 min进行巴氏灭菌后按装样量为300 mL分装至500 mL已灭菌的锥形瓶中，即为发酵原液。

酒精发酵：在无菌条件下向发酵原液中接入8%（V/V）酿酒酵母菌悬液，30 ℃恒温发酵，第1天以8层纱布封口，每隔8 h振荡一次。之后薄膜封口，静置发酵，酒精度至7%vol～8%vol且稳定即为酒精发酵结束。

醋酸发酵：在无菌条件下向发酵好的酒醪中接入10%（V/V）巴氏醋杆菌菌悬液和4%（V/V）植物乳杆菌菌悬液，8层纱布封口，30 ℃、转速150 r/min恒温振荡发酵，检测总酸至（3～4）g/100 mL且不再上升即醋酸发酵结束。

过滤灭菌：将发酵好的醋液用8层纱布过滤，100 ℃煮2～3 min即得山楂苦荞醋。

1.3.2 挥发性香气物质的测定方法

样品的制备：分别于酒精发酵第0～5天随机3个锥形瓶中各取酒醪样品300 mL混合备用，编号为：AF0～AF5；分别于醋酸发酵第1～7天随机3个锥形瓶中各取醋酸样品300 mL混合备用，编号为：AAF1～AAF7。

取5 mL样品通过顶空固相微萃取结合气质联用法[17]进行测定。

气相色谱条件：VF-5MS色谱柱（30m×0.25mm×0.25mm），载气为氦气（He），纯度为99.999%；流量：不分流，流速1 mL/min进样；程序升温：40 ℃保持3 min，以速度为4 ℃/min升至160 ℃，维持1 min，以速度为10 ℃/min升至270 ℃维持5 min。

质谱条件：接口温度、离子源温度均为280 ℃，电子能量70 eV，扫描质量范围41～500 amu。

1.3.3 总多酚、总黄酮含量的测定方法

取样品4 mL，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取1 mL上清，以Folin-Ciocalteu比色法[18]测定样品中总多酚含量；取样品5 mL，用10 g/L NaOH溶液调pH为中性，以蒸馏水定容至100 mL，摇匀备用，参考文献[18]的方法测定样品中总黄酮含量。

1.3.4 抗氧化活性的测定方法

取适量混匀的发酵样，参考文献[19]的方法，对羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、DPPH自由基清除率、亚铁离子螯合率的方法进行测定。

1.3.5 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 山楂苦荞醋发酵过程中总多酚、总黄酮的动态变化

由图1可知，在山楂苦荞醋发酵过程中，总多酚和总黄酮含量均在整体上呈现上升趋势，二者在醋酸发酵第7天达到峰值，分别为2.43 mg/mL和1.29 mg/mL。山楂、苦荞经果胶酶、糖化酶酶解预处理，使其中的多酚、黄酮类物质溶出。随酒精发酵进行，酒醪中酒精度升高，多酚、黄酮类物质在酒精中更易溶出，其含量快速升高。进入醋酸发酵后，总多酚、总黄酮含量较为稳定。

图1 山楂苦荞醋发酵过程总多酚及总黄酮含量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of total polyphenols and total flavonoids contents during the fermentation of hawthorn and tartary buckwhea vinegar

2.2 山楂苦荞醋发酵过程挥发性香气物质的动态变化

2.2.1 山楂苦荞醋酒精发酵过程挥发性香气物质的动态变化

按1.3.2中的方法对山楂苦荞醋酒精发酵过程中的挥发性香气进行测定，可知在山楂苦荞醋酒精发酵阶段中检测出58种挥发性物质，包括29种酯类、10种醇类、5种酸类、4种醛类、1种酮类和9种其他类挥发性物质。选取酒精发酵过程中各样品共有的25种香气成分绘制heatmap图，结果见图2。挥发性香气成分主成分分析结果见图3。

图2 山楂苦荞醋酒精发酵过程挥发性香气成分动态变化热图Fig.2 Heat map of dynamic changes of volatile aroma components during alcoholic fermentation of hawthorn and buckwheat vinegar

图3 山楂苦荞醋酒精发酵过程挥发性香气成分主成分分析得分图（A）与载荷图（B）Fig.3 Principal component analysis score (A) and loading (B)diagram of volatile aroma components during alcoholic fermentation of hawthorn and tartary buckwheat vinegar

由图2可知，酒精发酵样品AF1、AF2聚为一类，样品AF3～AF5聚为一类，样品AF0香气成分较少且比例不协调，单独成为一类。酒精发酵过程中主要的酯类物质包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸异戊酯、壬酸乙酯、山梨酸乙酯等；醇类物质主要是乙醇和异戊醇，乙醇含量随着酒精发酵天数的增加而持续增加，异戊醇含量在酒精发酵前3天增加较多；醛类物质含量较高的是正辛醛和壬醛。大部分挥发性香气成分在酒精发酵过程中呈现先上升后下降的趋势，发酵末期各种挥发性香气物质含量趋于稳定。

由图3可知，样品AF0和AF1分别分布于第二、三象限，这是由于在发酵初期，发酵体系中反应物充足，各反应迅速进行，香气种类增长较快[20]。样品AF2和AF3分布于第四象限，样品AF4和AF5分布于第一象限，这说明随发酵进行，发酵体系中反应物有所损耗，反应逐渐平稳，香气种类趋于稳定。结合载荷图分析可知，样品AF0和乙酸己酯、山梨酸乙酯等具有较高相关性；样品AF1和己酸甲酯具有较高相关性；样品AF2和AF3与癸醛、1-辛烯-3-醇、异戊醇、癸酸异戊酯等具有较高相关性；样品AF4和AF5与癸酸甲酯、壬醛、α-松油醇、异丁醇等具有较高相关性。

2.2.2 山楂苦荞醋醋酸发酵过程挥发性香气物质的动态变化

按1.3.2中的方法对山楂苦荞醋醋酸发酵过程中的挥发性香气变化进行测定，可知在山楂苦荞醋醋酸发酵阶段中共检测到60种挥发性物质，包括25种酯类、6种醇类、7种酸类、9种醛类、5种酮类、1种吡嗪类和7种其他类组分。与酒精阶段相比，酸类物质的总量和种类增加，醇类物质的总量和种类减少。选取醋酸发酵过程中各样品共有的36种香气成分绘制heatmap图，结果见图4，挥发性香气成分主成分分析结果见图5。

图4 山楂苦荞醋醋酸发酵过程挥发性香气动态变化热图Fig.4 Heat map of dynamic changes of volatile aroma components during acetic acid fermentation of hawthorn and buckwheat vinegar

图5 山楂苦荞醋醋酸发酵过程挥发性香气成分主成分分析得分图（A）与载荷图（B）Fig.5 Principal component analysis score (A) and loading (B)diagram of volatile aroma components during acetic acid fermentation of hawthorn and tartary buckwheat vinegar

由图4可知，醋酸发酵过程样品AAF1、AAF2聚为一类，样品AAF3、AAF4聚为一类，样品AAF5、AAF6聚为一类，样品AAF7香气成分较多且比例协调，单独成为一类。大部分挥发性香气物质在醋酸发酵过程中呈现先上升后下降的趋势。山楂苦荞醋醋酸发酵初期，发酵液中α-松油醇、苯乙醇含量较高。随着发酵进行，醋酸发酵样品中香气物质含量发生变化，乙酸、2-甲基丁酸、乙酸乙酯、辛酸乙酯、异戊醇、正辛醛等物质大量生成，其中乙酸含量呈现出不断上升趋势。挥发性酯类物质多具有花果香味，山楂苦荞醋中丰富的酯类物质赋予其良好的风味品质[21-22]，发酵末期各种挥发性香气物质含量趋于平衡。

由图5可知，样品AAF1、AAF2分布于第一象限，样品AAF3～AAF5分布于第四象限，样品AAF6、AAF7分布于第二象限，这是由于进入发酵后期，发酵液中成分接近稳定。结合载荷图分析可知，样品AAF1、AAF2和异戊酸、辛酸、乙酸苯乙酯等具有较高相关性；样品AAF3～AAF5和月桂酸乙酯、正辛醛、苯乙醇等具有较高相关性；样品AAF6、AAF7和2-甲基丁酸、3-甲基辛酸、壬醛等具有较高相关性。

2.3 山楂苦荞醋发酵过程中总多酚、总黄酮、挥发性香气物质与抗氧化活性的相关性

2.3.1 山楂苦荞醋发酵过程中抗氧化活性动态变化

山楂苦荞醋发酵过程中抗氧化活性指标的变化见图6。由图6可知，4种抗氧化活性指标在发酵过程中均呈先上升后平稳的趋势。羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率和DPPH自由基清除率都在酒精发酵第5天达到最大，分别为81.4%、52.3%和99.8%；亚铁离子螯合率在醋酸发酵第1天达到最高值90.6%。

图6 山楂苦荞醋发酵过程抗氧化活性的动态变化Fig.6 Dynamic changes of antioxidant activity during fermentation of hawthorn tartary buckwheat vinegar

2.3.2 山楂苦荞醋发酵过程中总多酚、总黄酮与抗氧化活性的相关性

通过皮尔森相关分析法，对发酵过程中总多酚、总黄酮的含量变化同抗氧化活性的相关性进行分析，结果见表1。由表1可知，总多酚和总黄酮的含量与4种抗氧化活性指标均呈极显著正相关（P＜0.01），其中，总多酚含量与亚铁离子螯合率、羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率相关性较强，且总多酚含量与抗氧化活性的相关性均高于总黄酮含量与抗氧化活性的相关性[23]。

表1 山楂苦荞醋发酵过程中总多酚及总黄酮的含量和抗氧化能力的相关性Table 1 Correlation between total polyphenol content,total flavonoid content and antioxidant ability during hawthorn tartary buckwheat vinegar fermentation

2.3.3 山楂苦荞醋发酵过程中挥发性香气物质与抗氧化活性的相关性

目前有许多学者对挥发性香气物质的抗氧化活性进行研究，据报道，有一些挥发性香气物质具有一定的抗氧化能力[24-25]。李红等[26]研究啤酒抗氧化指标与风味保鲜期的相关性时，发现多酚是主要的天然抗氧化剂。另外糠醛、5-甲基糠醛也曾被报道可用作抗氧化剂。山楂苦荞醋酒精发酵与醋酸发酵过程挥发性成分与抗氧化能力之间的相关性分析见图7。

图7 山楂苦荞醋酒精发酵（A）及醋酸发酵（B）过程挥发性成分与抗氧化能力之间的相关性Fig.7 Correlation between volatile components and antioxidant capacity during alcoholic fermentation (A) and acetic acid fermentation (B) of hawthorn tartary buckwheat vinegar

由图7A可知，山楂苦荞醋酒精发酵阶段与抗氧化活性相关的挥发性成分有12种。其中，羟基自由基清除率与己酸异丁酯（R=0.999）和己酸乙酯（R=0.850）均呈显著正相关（P＜0.05）。超氧阴离子清除率与乙酸异戊酯（R=0.970）呈极显著正相关（P＜0.01），与己酸异丁酯未统计出相关性，除苯丙酸乙酯、己-4-烯酸乙酯、己酸乙酯、异己酸乙酯外，同其他6种挥发性成分均呈显著正相关（P＜0.05）。DPPH自由基清除率与苯丙酸乙酯（R=-0.991）呈极显著负相关（P＜0.01），与己-4-烯酸乙酯（R=0.969）和异己酸乙酯（R=-0.923）分别呈显著正相关和显著负相关（P＜0.05）。亚铁离子螯合率与苯丙酸乙酯（R=-0.986）、异己酸乙酯（R=-0.913）均呈显著负相关（P＜0.05），与己-4-烯酸乙酯（R=0.987）呈显著正相关（P＜0.05）。在山楂苦荞醋酒精发酵阶段，抗氧化活性均明显上升，挥发性香气物质与超氧阴离子清除率的相关性较高。

由图7B可知，山楂苦荞醋醋酸发酵过程与抗氧化活性相关的挥发性成分有8种。其中，羟基自由基清除率与2-甲基丁基己酸酯（R=0.999）、正己酸乙酯（R=0.928）呈显著正相关（P＜0.05），与己酸异戊酯（R=0.927）、柠檬烯（R=0.950）均呈极显著正相关（P＜0.01）。超氧阴离子清除率与己-4-烯酸乙酯（R=0.991）、柠檬烯（R=0.964）呈极显著正相关（P＜0.01），与异戊酸己酯（R=0.997）、庚酸乙酯（R=0.993）、2-甲基辛酸丁酯（R=0.997）、己酸异戊酯（R=0.859）、正己酸乙酯（R=0.957）均呈显著正相关（P＜0.05）。DPPH清除率与己酸异戊酯（R=0.958）呈极显著正相关（P＜0.01），与柠檬烯（R=0.881）呈显著正相关（P＜0.05）。亚铁离子螯合率与己酸异戊酯（R=0.972）和柠檬烯（R=0.921）呈极显著正相关（P＜0.01）。在山楂苦荞醋醋酸发酵阶段，抗氧化活性较稳定，挥发性香气物质与抗氧化活性的相关性均较高。

3 结论

本研究主要对山楂苦荞醋发酵过程中总多酚含量、总黄酮含量、挥发性香气物质含量的变化规律，以及与羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率、亚铁离子螯合率的相关性进行了分析。结果表明，在山楂苦荞醋发酵过程中，总多酚、总黄酮含量呈现上升趋势，在酒精发酵阶段两者含量增长明显，醋酸发酵阶段中较稳定。总多酚、总黄酮的含量与4种抗氧化活性均呈极显著正相关（P＜0.01），其中总多酚和总黄酮含量分别与亚铁离子螯合率和DPPH自由基清除率的相关系数R最高，为0.984和0.870。在发酵过程中，大部分挥发性香气物质含量在整体上呈现上升后下降的趋势，香气成分分布符合发酵天数走向。共有20种挥发性香气成分与抗氧化活性具有相关性，抗氧化活性的变化主要在酒精发酵阶段明显递增，且酒精发酵阶段与抗氧化活性有相关性的挥发性香气物质种类明显多于醋酸发酵阶段。