有机酸含量对葡萄酒发酵的影响

何 丹，马欣娟，康 强，孙玉梅

（1.华润雪花啤酒（秦皇岛）有限公司，河北 秦皇岛 066000；2.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；3.秦皇岛泰治医疗科技有限公司，河北 秦皇岛 066000）

有机酸是评价葡萄酒品质的重要指标，可改善葡萄酒的整体协调性。葡萄酒中主要有机酸有酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酮酸等，其中苹果酸和酒石酸占总酸含量的90%以上[1]。酒石酸、苹果酸和柠檬酸来源于葡萄本身的含量较多，而乳酸、乙酸、琥珀酸和丙酮酸主要在发酵过程中产生[2]。酒石酸是葡萄酒中重要有机酸之一，含量一般为4.5～10.0 g/L[3]，它酸性较弱、酸味生硬尖锐，且在酿造过程中较稳定、不被代谢，常用来提高原料酸度[4]。苹果酸也是葡萄酒中重要的有机酸，含量较高时赋予酒体酸涩感，需要乳酸菌进一步将其转化，从而使葡萄酒口感更细腻柔和[5]。葡萄酒中的乳酸主要在苹果酸-乳酸发酵过程产生[1]，其口感柔和、酸味较低，对改善葡萄酒口感有正向作用[6]。乙酸是葡萄酒酸味与醋味的主要来源，主要产生方式是乙醛通过乙醛脱氢酶转化而来[7-8]。琥珀酸作为三羧酸循环的中间体[9]，在葡萄酒发酵过程起着至关重要的作用，直接影响葡萄酒的总酸含量[10-11]，一般葡萄酒中琥珀酸含量约为0.5～1.0 g/L[3]。柠檬酸含量较高时可抑制酵母的生长。丙酮酸作为酒精发酵的中间产物存在于葡萄酒中[12-13]，在发酵开始时形成并在发酵结束时减少[3]，并赋予葡萄酒微酸味。

葡萄中的有机酸含量过高或过低均会影响葡萄酒的整体协调性。当葡萄的酸度较低或pH值较高时会加速腐败微生物的生长[3]，影响葡萄酒的生物稳定性，且产生的不良副产物（如乙醛、乙酸）较多[14-15]；酸度较高的葡萄中一般苹果酸含量较高[16]，而葡萄酒酵母降解苹果酸能力较差，容易出现酸涩感。酿酒葡萄的酸度在6～10 g/L之间所得葡萄酒的甜度、酸度及香气成分相对平衡[17]。因此，该研究考察原料的酸度对葡萄酒发酵及质量的影响，对进一步优化发酵工艺、提高葡萄酒品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商业酿酒酵母ST（活性干酵母）：桓仁五女山米兰酒业有限公司。

葡萄糖、果糖（均为分析纯）：山东西王药业有限公司；酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乙醇、乙酸异戊酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、乙酸乙酯、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸（分析纯）：天津市恒兴化学试剂有限公司；乙醛、β-苯乙醇（均为色谱纯）、乳酸、丙酮酸、丁酸乙酯、己酸乙酯（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZHJH-C2109B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；Avanti J-E型离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；GC-8900气相色谱仪、DB-FFAP毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）、N2000气相色谱工作站、Agilent Poroshell EC-C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）：安捷伦科技有限公司；Hitachi Primaide高效液相色谱仪：天美（中国）科学仪器有限公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅：宁波市开普电子仪器有限公司；SHP-150生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；722S分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；E221生物显微镜：麦克奥迪实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基配制

斜面培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.0。

模拟葡萄汁的配制[18]：葡萄糖100 g/L、果糖100 g/L、可同化氮250 mg N/L、柠檬酸0.3 g/L、硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾5 g/L和偏重亚硫酸氢钾0.12 g/L。

将以上培养基均于121 ℃灭菌30 min。

1.3.2 酵母活化

称取1 g活性干酵母ST溶于10 mL无菌水中，40 ℃恒温水浴培养15 min，每间隔5 min摇晃一次。将上述培养基接入至10 mL 20°Bx模拟葡萄汁，25 ℃恒温水浴中培养1 h，每培养30 min摇晃一次。再将上述培养及接入20 mL 40°Bx模拟葡萄汁，20 ℃恒温水浴中培养2 h，每培养30 min摇晃一次。

1.3.3 实验设计

用酒石酸与苹果酸（其中酒石酸∶苹果酸=2.5∶1.0[4]）将模拟葡萄汁总酸度调整至4 g/L、7 g/L和10 g/L（以酒石酸计），再用饱和碳酸氢钾溶液将其pH值调整至3.30。

1.3.4 发酵条件

每个实验条件做3个平行样。1 L三角瓶装600 mL模拟葡萄汁，灭菌后接入0.15 g酵母活化液，用棉塞封口，置于25 ℃培养箱发酵，第4天用发酵栓替换棉塞继续发酵，当发酵液残糖含量3 d基本不变时终止发酵。

1.3.5 样品取样及处理方法

取样频次：每隔3 d一次；样品处理方法：在无菌条件下将发酵液混匀，取50 mL发酵液于4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清，保存于-20 ℃冰箱。

1.3.6 分析检测

酵母活细胞浓度：用血球计数板法测定酵母活细胞浓度（细胞/mL）[19]；总酵母细胞浓度：利用紫外分光光度计检测，以波长600 nm处的吸光度值来表示；还原糖含量：用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[20]测定；总酸含量：用酸碱滴定法[21]测定；pH值：用pH计测定；醇类、酯类化合物、乙醛及乙酸等挥发性物质含量：采用气相色谱法测定[22]；有机酸含量：采用高效液相色谱法测定[23]。

气相色谱条件：向15 mL顶空气相瓶中依次加入1.4 g氯化钠、7 mL发酵液上清和磁力搅拌转子，用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethene，PTFE）垫密封，并置于磁力搅拌器上，在常温、350 r/min条件下搅拌10 min。色谱条件：采用安捷伦DB-FFAP毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始温度40 ℃保持10 min，以5 ℃/min速率升温至180 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升温至230 ℃，保持2 min；载气（氮气）流量10 mL/min，氢气流量30 mL/min，空气流量300 mL/min，分流比10∶1；进样量2 μL。

高效液相色谱条件：将离心后的发酵液上清用0.22 μm有机滤膜过滤后，加入液相小瓶中。色谱条件：Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 μm），紫外检测器，检测波长215 nm，设定柱温30 ℃，进样量10 μL，流速0.6 mL/min，流动相为0.02 mol/L（NH4）H2PO4（用H3PO4调节pH至2.50±0.02）∶甲醇=95∶5（V/V），分析时间35 min。

1.3.7 数据处理

每个试验重复3次，数值为3次独立实验的平均值±标准偏差。使用Excel 2019对数据进行制图。使用IBM SPSS Statistics19.0软件进行显著性差异分析，然后以P＜0.05的水平确定显著性。

2 结果与分析

2.1 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中酵母生长的影响

不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程酵母生长的影响见图1。由图1可知，不同初始有机酸含量发酵的酵母活细胞浓度在前3 d迅速增加，第3天后活细胞浓度下降，到第18天后开始缓慢上升。不同初始有机酸含量酵母活细胞浓度的差异显著（P＜0.05），在发酵前18 d，有机酸含量越高，酵母活细胞浓度越高，但初始有机酸含量7 g/L发酵18天后酵母活细胞浓度明显低于其他两组。由图1可知，不同初始有机酸含量发酵的总酵母细胞浓度在前3 d迅速增加，之后缓慢增加，到第9天开始趋于稳定。在发酵前9 d，有机酸含量越高，总酵母细胞浓度越高，但初始有机酸含量7 g/L发酵9 d后总酵母细胞浓度略低于其他两组。

图1 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中酵母生长的影响Fig.1 Effect of different initial organic acids contents on yeast growth during wine fermentation process

在发酵初期，氧气与营养充足，酵母繁殖迅速，酵母活细胞浓度和总细胞浓度快速升高；随着营养物质的消耗与代谢产物的积累导致酵母活细胞浓度下降，总细胞浓度不再显著增加；发酵18 d后由于酵母自溶后释放出部分营养物质再次被利用，导致活细胞浓度缓慢上升。在葡萄酒发酵初期，酵母菌生长量的差异主要是因为葡萄浆中有机酸含量的差异，表现出酵母活细胞浓度和总细胞浓度随初始酸度的增加而增加。但发酵中后期，酵母生长和代谢使葡萄浆中原组成分减少，而代谢产物增加，不同初始有机酸含量的葡萄浆发酵后的各组成分不再呈最初的梯度，酵母量也不再呈发酵初期的梯度。所以，酵母生长和代谢的综合效果使初始有机酸含量7 g/L发酵9 d和18 d后的酵母活细胞数和总细胞数较低。

2.2 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中残糖量的影响

由图2可知，不同初始有机酸含量发酵的葡萄酒残糖量变化趋势基本一致，在0～6 d快速下降，酵母利用营养物质快速繁殖，6～9 d残糖变化速率大幅降低，随营养物质消耗及代谢产物增加抑制了酵母生长代谢，第9天后残糖趋于稳定。不同初始有机酸含量在发酵前期耗糖变化显著（P＜0.05），但发酵终了差异并不显著。初始有机酸含量为10 g/L时耗糖最快，其次是初始有机酸含量4 g/L组，初始有机酸含量为7 g/L时耗糖最慢，可能初始有机酸含量7 g/L组在发酵过程中生成了较多抑制酵母菌生长和耗糖的代谢产物。这与彭媛媛等[24]的研究结果一致，在霞多丽葡萄的发酵过程也发现酸度为10 g/L时耗糖明显快。

图2 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中残糖含量的影响Fig.2 Effect of different initial organic acids contents on reducing sugar content during wine fermentation process

2.3 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中乙醇含量的影响

由图3可知，不同初始有机酸含量发酵的葡萄酒乙醇含量变化趋势基本一致。在0～3 d乙醇产生速率最大，3～6 d乙醇产生速率稍下降，6 d后乙醇含量趋于稳定。不同初始有机酸含量乙醇含量之间差异显著（P＜0.05），初始有机酸含量10 g/L时产乙醇量最多、其次为4 g/L初始有机酸含量组，初始有机酸含量为7 g/L产乙醇量最少。因初始有机酸含量为7 g/L的总酵母细胞数少，降糖慢，相应产乙醇量也低。

图3 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中乙醇含量的影响Fig.3 Effect of different initial organic acids contents on ethanol content during wine fermentation process

2.4 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中乙醛含量的影响

由图4可知，不同初始有机酸含量发酵葡萄酒中的乙醛含量变化趋势基本一致。在0～3 d乙醛快速生产，3～6 d乙醛含量大幅下降，6 d后乙醛含量变化幅度较小。不同初始有机酸含量发酵葡萄酒中乙醛含量之间的差异显著（P＜0.05），初始有机酸含量10g/L时产乙醛量最多、初始有机酸含量为4g/L次之，初始有机酸含量为7g/L时产乙醛量最少。因初始有机酸含量为7g/L的总酵母细胞数少，降糖慢，相应产乙醛含量也低。

图4 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中乙醛含量的影响Fig.4 Effect of different initial organic acids contents on acetaldehyde content during wine fermentation process

2.5 不同初始有机酸含量葡萄酒发酵的总酸含量和pH值

由图5A可知，初始有机酸含量越高，总酸净增值越小，初始有机酸含量10 g/L的葡萄酒中总酸净增值出现下降，说明在发酵过程中抑制产酸。由图5B可知，pH值呈先下降后增加的趋势。初始有机酸含量越高，pH下降幅度越小，这与生成有机酸的解离常数有关[25]，如果生成的有机酸解离能力强，pH就可能降低。

图5 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中总酸含量（A）和pH值（B）的影响Fig.5 Effect of different initial organic acids contents on the total acid content (A) and pH (B) during wine fermentation process

2.6 不同初始有机酸含量葡萄酒发酵的有机酸含量

监测了葡萄酒发酵过程中酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸和乙酸含量的变化，结果见图6。

图6 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程中有机酸含量的影响Fig.6 Effect of different initial organic acids contents on organic acids contents during wine fermentation process

由图6A可知，在发酵过程中各组酒石酸含量呈下降趋势，初始有机酸含量越高，下降幅度也越大，这是因为酒石酸被降解或通过形成酒石酸氢钾沉淀[23]从而使酒石酸含量一直下降。由图6B可知，在发酵过程中各组苹果酸含量呈先上升后下降趋势，初始有机酸含量越高，下降时间越晚，下降幅度也越大，这是因为在发酵初期通过有机酸和糖代谢生成较多的苹果酸使其含量先升高，而后被代谢或利用使其含量下降。由图6C可知，在发酵过程中各组柠檬酸含量呈下降趋势，随后小幅上升后又下降，初始有机酸含量较高组上升较晚而再下降较早，直至发酵后期差异不明显，说明柠檬酸、苹果酸和琥珀酸作为三羧酸循环的中间产物相互转化。由图6D可知，在发酵过程中各组乳酸含量呈先上升后下降趋势，在发酵21 d后下降，初始有机酸含量越低生成乳酸含量越高。由图6E可知，在发酵过程中各组琥珀酸含量呈先上升后下降趋势，在发酵15 d后下降，初始有机酸含量越高生成琥珀酸含量越高。由图6F可知，在发酵过程中各组乙酸含量呈上升趋势，这是因为发酵初期糖浓度较高，酵母通过消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸—还原型辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）产甘油而使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸—辅酶Ⅰ（NAD+）过量，再将乙醛转化为乙酸再生成NADH[3]来平衡高水平的NAD+。初始有机酸含量越高乙酸上升越慢，在发酵后期乙酸含量差异不显著。苏鹏飞等[26]研究酸度为7.73 g/L和8.03 g/L的葡萄浆发酵情况也有类似结果。

在不同初始有机酸含量的葡萄酒发酵过程中，随初始有机酸含量升高，酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸及柠檬酸呈下降趋势，琥珀酸呈上升趋势。与初始酸度4 g/L的和10 g/L相比，初始酸度7 g/L发酵后柠檬酸和乙酸产量较多，而较高浓度的柠檬酸和乙酸会抑制酵母的生长[12-13]。

2.7 不同有机酸含量的葡萄酒发酵的高级醇含量变化

由表1可知，随发酵时间的延长，高级醇含量呈上升的趋势，在整个发酵过程中正丙醇、异戊醇及异丁醇占总高级醇含量的90%以上。不同初始有机酸含量对正丙醇和异戊醇的含量影响显著（P＜0.05），这与翟婉丽等[27]对不同酸度葡萄酒发酵的研究结果类似。随初始有机酸含量的升高，正丙醇与异戊醇呈上升趋势，β-苯乙醇与正丁醇变化幅度不明显。发酵结束时初始有机酸含量为10 g/L的异丁醇和总高级醇含量相对较高，其次为4 g/L、7 g/L初始有机酸含量条件下高级醇含量最低，这是酵母菌生长和代谢的综合效果。

表1 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程高级醇含量的影响Table 1 Effect of different initial organic acids content on higher alcohol contents during wine fermentation process

续表

2.8 不同初始有机酸含量的葡萄酒发酵的酯类化合物含量变化

由表2可知，在整个发酵过程中乙酸乙酯占总酯含量的90%以上。随发酵时间的延长，乙酸乙酯大幅上升，乙酸异戊酯与丁酸乙酯先增加后降低，己酸乙酯呈下降的趋势。发酵结束时初始有机酸含量为4 g/L的乙酸乙酯和总酯含量相对较高，其次为10 g/L初始有机酸含量组，7 g/L组酵母生长及代谢均受到不同程度的抑制，因此酯含量最低。结果表明，初始有机酸含量高抑制乙酸乙酯与总酯的生成。

表2 不同初始有机酸含量对葡萄酒发酵过程酯类化合物含量的影响Table 2 Effect of different initial organic acids content on esters contents during wine fermentation process

3 结论

在不同初始有机酸含量的葡萄酒发酵特性显著不同。初始有机酸含量7 g/L组葡萄酒对应的酵母生长和耗糖最慢，乙醇和乙醛的产生量最低；初始有机酸含量4 g/L组稍高；初始有机酸含量10 g/L组最高。随初始有机酸含量升高，酒石酸及苹果酸净增值、pH值、乳酸、乙酸、总酸、乙酸乙酯及总酯含量呈下降趋势；琥珀酸、正丙醇、异丁醇、异戊醇及总高级醇含量呈上升趋势；但对β-苯乙醇、正丁醇以及丁酸乙酯含量影响较小。初始有机酸含量为10 g/L的酵母生长快、降糖最快，产酸含量适中，同时香气较好。综合分析，初始有机酸含量为10 g/L适宜葡萄酒发酵。