响应面法优化信阳地区霉豆渣发酵工艺和营养成分分析

张 杰，韩亚飞，乔妍妍，游新侠*

（郑州科技学院 食品科学与工程学院，河南 郑州 450064）

我国是大豆生产加工大国，豆制品企业数量众多，产生的大豆副产品也较多，副产品中的豆渣水分含量较高，营养成分丰富，不能及时处理容易腐烂变质，造成严重的浪费[1]。因此，实现豆渣的再利用，使其变废为宝成为近年来的研究热点，主要表现在提取豆渣营养成分[2-5]、制作豆渣饲料[6-9]和开发豆渣食品[10-12]等方面。

霉豆渣是我国传统的豆渣食品，主要分布在湖北省和河南省信阳市等地区，其发酵工艺为将豆渣加入少量的黄浆水或饮用水均匀搅拌后，进行蒸制、翻炒、放凉，手捏成团放在干净的稻草上进行自然发酵，待豆渣表层长出大量白色绒毛即可。它不仅能使豆渣中蛋白质和不溶性膳食纤维在一定程度上得到降解，产生奇特的发酵风味，还能增加豆渣中游离氨基酸的含量，提高豆渣的可吸收性和营养性[13]。另有研究表明，发酵后的霉豆渣具有抗氧化、降血压、抑制糖尿病和降低胆固醇等多种功能性作用[14-16]。目前，霉豆渣的研究集中在菌种多样性研究[17-19]、发酵剂的制备与优化[20-22]、营养成分及功能性研究[23-25]等方面，对于霉豆渣的工艺优化研究较少。姚英政[26]采用分段发酵方法对湖北地区的霉豆渣粑发酵工艺进行了优化，确定其最佳发酵工艺为：28 ℃条件下发酵18 h，降温至24 ℃发酵4 h、再降温至20 ℃发酵62 h，此时的霉豆渣粑营养价值得到了较大提升。

传统霉豆渣的制作主要是依照工作人员的经验，以当地环境中特有的霉菌作为发酵剂进行自然发酵，因此不同地区霉豆渣的制作工艺和口味略有差别。本试验以干豆渣粉为主要原料制备霉豆渣，参照河南信阳的霉豆渣制作工艺，以纯发酵剂代替天然发酵剂，感官评分及氨基酸态氮含量为评价指标，采用单因素试验及响应面法对其发酵工艺进行优化，并对霉豆渣营养成分进行分析，为霉豆渣的工业化生产提供一定的理论支持，以期为传统美食霉豆渣进行推广。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干豆渣粉：郑州市祥云食品有限公司；毛霉菌粉（10 000 CFU/mg）：沂水锦润生物科技有限公司；体积分数95%乙醇（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；石油醚（30～60 ℃）：郑州派尼化学试剂厂；热稳定α-淀粉酶（酶活10 000 U/mL）、蛋白酶液（酶活300～400 U/mL）、淀粉葡萄糖苷酶液（酶活2 000～3 000 U/mL）：上海蓝季生物试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1204型分析天平：上海力辰仪器科技有限公司；GRP-9080型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；HH-1型电热恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器有限公司；UV-4802型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DZF-6050A型真空干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；BBS-SDC型超净工作台：济南鑫贝西生物技术有限公司；BSXT-02型索氏抽提器：上海贺帆仪器有限公司；KDN-08B（04B）型凯氏定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司；YXQ-50A型立式高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 霉豆渣发酵工艺流程及操作要点[22]

干豆渣粉预处理→浸泡→灭菌→接种→搅拌成型→发酵→霉豆渣

操作要点：

干豆渣粉预处理：挑选干燥、无霉烂、不变质的豆渣粉，过60目筛后备用。

浸泡：准确称取100 g预处理过的干豆渣粉，添加质量比为80%的纯净水混合搅拌均匀，室温下浸泡12 h。

灭菌：浸泡好的豆渣在115 ℃条件下灭菌30 min。

接种：取干豆渣粉质量的2%的发酵菌种溶于少量蒸馏水中，无菌环境下，采用直投式的方法接入灭过菌的豆渣中，混合均匀。

搅拌成型：用手将接种好的豆渣，捏制成团，置于干燥的豆腐框中，框上依次覆盖一层带小孔的保鲜膜和一层豆腐盖布，便于豆渣的保湿和发酵菌种的呼吸。

发酵：将接种过的湿豆渣放置于发酵箱中，28 ℃条件下发酵48 h，直至菌丝完全覆盖表面，霉香味浓郁，发酵完成。

1.3.2 霉豆渣发酵工艺优化单因素试验

以100 g干豆渣粉为基础，设定水分添加量分别为70%、75%、80%、85%、90%，菌种添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，温度分别为24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，发酵时间分别为24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，进行单因素试验，考察水添加量、菌种添加量、发酵温度和发酵时间对霉豆渣感官评分和氨基酸态氮含量的影响，其中以感官评价为主要评价指标。

1.3.3 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，选取对结果影响较大的水添加量（A）、菌种添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为自变量，以感官评分为响应值（Y），进行4因素3水平的Box-Behnken响应面试验，因素与水平见表1。

表1 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for Meitauza fermentation process optimization

1.3.4 霉豆渣的感官评价

选取10名感官评价人员从霉豆渣的外观（20分）、气味（30分）、滋味（30分）、质地（20分）四个方面进行评价，满分为100分，并取平均值，霉豆渣的感官评分标准[13]见表2。

表2 霉豆渣的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of Meitauza

续表

1.3.5 霉豆渣理化指标的检测方法

氨基酸态氮含量的测定：根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的比色法进行；蛋白质含量的测定：根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行；脂肪含量的测定：根据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法进行；膳食纤维含量的测定：根据GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》进行；总酸含量的测定：根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》进行。

1.3.6 试验数据处理方法

利用OriginLab OriginPro 8.5和Design Expert.V8.0.6软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 霉豆渣发酵工艺优化单因素试验结果

2.1.1 水分添加量对霉豆渣品质的影响

水分添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图1。

图1 水分添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of water addition on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由图1可知，当水分添加量为70%～85%时，由于含水量较低，不利于微生物的生长，发酵出的霉豆渣表面菌丝较稀疏，质地较为松软，氨基酸态氮含量相对较低，表明霉豆渣中游离氨基酸含量较低；当水分添加量为85%时，水分充足，微生物生长迅速，霉豆渣表面覆盖稠密菌丝，质地软硬适中，弹性较好，霉香味浓郁，滋味鲜美，具有霉豆渣特殊风味，此时感官评分和氨基酸态氮含量达到最高，分别为83.5分、7.89 mg/g；当水分添加量＞85%之后，霉豆渣含水量较高，呈糊状，质地偏软，弹性较差，口感过于绵软，感官评分有所下降，微生物生长依旧迅速，氨基酸态氮含量相对稳定不变。综合考虑，最佳水分添加量为85%。

2.1.2 菌种添加量对霉豆渣品质的影响

菌种添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图2。

图2 菌种添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of culture addition on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由图2可知，当菌种添加量为1.0%～2.0%时，霉豆渣的感官评分与氨基酸态氮含量随菌种添加量增加而上升；当菌种添加量为2.0%时，霉豆渣口感和滋味达到最佳，感官评分达到最高，氨基酸态氮含量较高，分别为80.5分、7.90 mg/g；当菌种添加量为2.0%～2.5%时，霉豆渣开始出现氨味，影响霉豆渣整体风味，感官评分开始下降，氨基酸态氮含量继续缓慢升高；当菌种添加量为2.5%时，氨基酸态氮含量达到最高，为8.52 mg/g；当菌种添加量＞2.5%之后，过量的微生物开始消耗部分游离氨基酸，氨基酸态氮含量逐渐下降。综合考虑，最佳菌种添加量为2.0%。

2.1.3 发酵温度对霉豆渣品质的影响

发酵温度对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图3。

图3 发酵温度对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由图3可知，当发酵温度为24～28 ℃时，温度偏低导致霉菌生长繁殖及代谢活动较为缓慢，发酵不充分，霉豆渣表面菌丝较为稀疏，内外颜色不一，风味不够明显；随着发酵温度的升高，霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量逐渐上升，当发酵温度达到28 ℃时，霉菌生长迅速，发酵速度加快，霉豆渣表面菌丝密且长，霉香味明显，煎炸之后有明显香味与鲜味，此时感官评分和氨基酸态氮含量达到最高，分别为85.6分、8.10 mg/g；当发酵温度高于28 ℃之后，杂菌开始繁殖代谢，消耗霉豆渣中的营养物质，氨基酸态氮含量缓慢降低，豆渣出现腐烂味，导致感官评分下降。综合考虑，最佳发酵温度为28 ℃。

2.1.4 发酵时间对霉豆渣品质的影响

发酵时间对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图4。

图4 发酵时间对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由图4可知，随着发酵时间在24～72 h范围内的增加，霉豆渣感官评分呈先增加后下降的趋势，氨基酸态氮含量呈先上升后缓慢降低的趋势。当发酵时间在24～48 h之间时，霉菌处于增殖阶段，降解蛋白质速度低，游离氨基酸含量较少，霉豆渣风味不明显；当发酵时间为48 h时，霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量达到最高，分别为82.6分、8.03 mg/g；当发酵时间＞48 h之后，发酵时间过长，霉豆渣出现腐烂味与氨味，影响整体风味，导致感官评分降低。综合考虑，最佳发酵时间为48 h。

2.2 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

在单因素试验结果基础上，以感官评分（Y）作为响应值，水分添加量（A）、菌种添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为自变量，采用Box-Behnken响应面法进行优化，筛选出霉豆渣的最佳发酵工艺参数，响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for Meitauza fermentation process optimization

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

续表

采用Design Expert.V8.0.6数据分析软件对表3响应面试验的结果进行回归拟合，得到模型的二次多项回归方程为：

由表4可知，该模型P＜0.000 1，极显著，说明通过本次霉豆渣发酵工艺优化结果很好；失拟项P=0.070 1＞0.05，不显著，说明理论和实际值偏差较小，拟合度较高，可以通过得到的回归拟合方程预测结果。一次项A、C、D、交互项AD、BD及二次项A2、B2、C2、D2对霉豆渣感官评分的影响极显著（P＜0.01）。决定系数R2=0.979 1，说明此模型相关度良好，调整决定系数R2adj=0.958 1，表明此模型中的95.81%霉豆渣的感官评分变化来自于自变量A、B、C、D。通过F值大小和显著水平可知，影响感官评分的各因素顺序为发酵时间（D）＞发酵温度（C）＞水添加量（A）＞菌种添加量（B）。

2.2.2 交互作用响应面分析

各因素间交互作用影响霉豆渣感官评分的响应曲面图及等高线见图5。

图5 各因素间交互作用对霉豆渣感官评分影响的响应曲面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Meitauza

由图5可知，当水添加量、菌种添加量、发酵温度和发酵时间两两交互作用时，对霉豆渣的感官评分均有一定影响，各响应面陡峭程度及等高线椭圆化程度存在一定差异，其中AD、BD坡面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，表明A与D、B与D之间具有良好的交互作用，对霉豆渣感官评分影响较大。在AB、AC、AD和BC坡面上，感官评分随A、B、C、D的增加呈现先迅速升高后缓慢降低的变化趋势；在BD和CD坡面上，感官评分随B、C、D的增加呈现缓慢升高后迅速降低的变化趋势，说明感官评分有最大值点。

由Design Expert.V8.0.6软件预测得出霉豆渣最佳发酵工艺为：水分添加量85.35%，菌种添加量1.98%，发酵温度29.12 ℃，发酵时间39.58 h，此时感官评分最高理论值为87.12分。结合实际操作，将发酵工艺修正为：水分添加量85%，菌种添加量2.0%，发酵温度29 ℃，发酵时间40 h。在此优化发酵工艺条件下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为89.7±1.2分，与预测值接近，表明该工艺真实可行。

2.3 霉豆渣理化指标检测结果

对采用最优发酵工艺制作的霉豆渣的理化指标进行检测，结果见表5。

由表5可知，霉豆渣的各项指标均符合GB 2712—2014《食品安全国家标准豆制品》，对比发酵前豆渣和发酵后霉豆渣的营养成分，霉豆渣发酵过程中营养物含量发生了变化。氨基酸态氮含量由1.12 mg/g上升至8.75 mg/g，蛋白质含量由33.8 g/100 g下降至20.1 g/100 g，表明在微生物的作用下，部分蛋白质转变成了游离氨基酸，这使得霉豆渣产生特殊风味；脂肪含量由8.7 g/100 g下降至6.9 g/100 g，不可溶性膳食纤维含量由39.2 g/100 g下降至31.8 g/100 g，可溶性膳食纤维含量由10.6 g/100 g上升至12.5 g/100 g，总酸含量由6.2 g/kg上升至7.3 g/kg，表明霉豆渣在微生物发酵作用下向着低脂肪、高可溶性膳食纤维的方向转变，使得其营养价值更高，更容易消化吸收。

表5 发酵前豆渣及霉豆渣理化指标的检测结果Table 5 Determination results of physical and chemical indexes of okara before fermentation and Meitauza

3 结论

以信阳地区霉豆渣发酵工艺为基础，通过单因素试验和响应面试验优化，得到霉豆渣的最佳发酵工艺条件为以100 g干豆渣粉为基础，水分添加量85%，菌种添加量2.0%，发酵温度29 ℃，发酵时间40 h，采用优化工艺制作出的霉豆渣菌丝稠密，质地均匀、有弹性，内外均为土黄色，有发酵的霉香味，煎炸之后香气浓郁、味道鲜美，感官评分达87.1分。同时，与发酵前豆渣相比，霉豆渣营养品质得到改良，氨基酸态氮含量由1.12 mg/g上升至8.75 mg/g，蛋白质含量由33.8 g/100 g下降至20.1 g/100 g，脂肪含量由8.7 g/100 g下降至6.9 g/100 g，不可溶性膳食纤维含量由39.2 g/100 g下降至31.8 g/100 g，可溶性膳食纤维含量由10.6 g/100 g上升至12.5 g/100 g，总酸含量由6.2 g/kg上升至7.3 g/kg。本次研究确定了信阳地区霉豆渣的发酵工艺参数，分析了霉豆渣的营养成分变化，可为其工业化生产奠定理论基础。