高效液相色谱法测定浓香型白酒中己酸的结果不确定度评定

夏 燕，张瑞景 *，李大海，朱正军，徐 健

（1.湖北琪谱检测技术有限公司，湖北 武汉 430068；2.湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；3.丹阳颐和食品有限公司，江苏 镇江 212300）

己酸是一种挥发性脂肪酸，具有椰子油脂气味，作为食用香料广泛应用于干酪、奶油和水果香精中，同时也是浓香型白酒中主要的酸类物质之一[1-2]。浓香型白酒中的己酸主要由白酒发酵窖泥中的己酸菌代谢产生[3-4]，其含量受窖龄、窖泥质量、大曲质量等多种因素的影响[5-6]。适当含量的己酸可以增加浓香型白酒的浓郁感和丰满度，使酒体窖香突出、更具浓厚感[7-8]。此外，己酸还是生成浓香型白酒主体香味物质己酸乙酯的重要前体物质，作为评判浓香型白酒品质优劣的关键指标，酒体中己酸乙酯的含量与己酸的含量呈正相关[9-11]。

在GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求第1部分：浓香型白酒》标准中，对浓香型白酒中己酸和己酸乙酯含量的总和做出了规定[12]。因此，准确测定酒体中己酸的含量对于指导白酒企业的实际生产具有重要意义。目前，己酸的检测方法主要包括比色法、纸层析法、硫酸铜显色法以及气相色谱法等[13-14]。其中，比色法、纸层析法和硫酸铜显色法不能准确检测出样品中己酸的含量，因此多用于生产过程中的快速检测[15]。酒样中的己酸含量多采用气相色谱法进行测定[16-17]，但该方法实际应用时存在峰形不对称、拖尾等现象[8，18]，对己酸的精确定量具有一定影响。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）具有灵敏度高、分离效率好、前处理简单等特点[19]，被广泛应用于发酵过程中柠檬酸[20]、山梨酸[21]、乳酸[22]、乙酸[23]等有机酸的检测。因此，本试验采用高效液相色谱法对浓香型白酒中的己酸含量进行测定。

不确定度是与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性[24]。对测量结果不确定度进行考察，可以有效反映检测过程中不同步骤、不同处理方法对检测结果的影响情况以及测量结果的可靠性，对于评定检测方法的优劣具有重要意义[25]。本试验依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[26]、JJG 20—2001《标准玻璃量器》[27]、JJG 196—2006《常用玻璃量器》[28]和CNAS-GL006—2019《化学分析中不确定度的评估指南》[29]中不确定度评定的基本程序，评定高效液相色谱法测量浓香型白酒中己酸含量的不确定度，为浓香型白酒的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

己酸标准品（编号为DRE-C14196000）：LGCDR.GmbH公司（纯度98.55%），不确定度U=0.44%；乙腈（液相色谱级）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甲磺酸（色谱级）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；乙醇（色谱级）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验所用其他试剂均为国产分析纯。

浓香型白酒样品：酒精度为55.81%vol（20 ℃），湖北工业大学酿酒中试基地提供。

1.2 仪器与设备

Thermo U3000 高效液相色谱仪、Acclaim OA色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：赛默飞世尔科技公司；AS 220.R1分析天平：波兰RADWAG公司；Direct-Q 5 UV纯水仪：美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HPLC流动相的配制

本试验所用HPLC流动相包括乙腈、2.5 mmol/L甲磺酸溶液以及100 mmol/L硫酸钠溶液。

100 mmol/L硫酸钠溶液：准确称取14.204 g硫酸钠用纯水溶解，加入300 μL甲磺酸调节pH至2.6后，用纯水定容至1 L；2.5 mmol/L甲磺酸溶液：准确吸取162 μL甲磺酸用纯水定容至1 L。上述所配流动相经0.22 μm滤膜进行过滤，并经超声脱气30 min后使用。

1.3.2 HPLC分析条件

本试验所用HPLC配备Acclaim OA色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外检测器，柱温为25 ℃，检测波长为210 nm。流动相：（A）100 mmol/L硫酸钠溶液、（B）乙腈、（C）2.5 mmol/L甲磺酸溶液，流速：0.8 mL/min。梯度洗脱程序为0 min：100%A；6 min：100%A；10 min：100%C；13 min：100%C；20 min：80%B和20%C；25 min：80%B和20%C。

1.3.3 标准溶液的配制

准确量取50 μL己酸标准品于10 mL的容量瓶中，并置于分析天平上称量其质量为45.2 mg，用10%乙醇溶液进行定容，得到实际质量浓度为4.45 mg/mL的己酸母液。用量程为100 μL或1 mL的移液器分别吸取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL的己酸母液置于10 mL的容量瓶中，用纯水进行定容，得到不同浓度的己酸单标，经孔径为0.22 μm的针头式滤器过滤后，备用。

1.3.4 酒样的处理

准确吸取0.1 mL酒样，用纯水定容至5 mL，摇匀后经0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于液相小瓶中作为待测样品供HPLC分析。

1.3.5 己酸含量的测定

样品中的己酸含量计算：由HPLC上测得的己酸的峰面积，根据Chromeleon 7软件拟合得到的标准曲线计算得出。

浓香型白酒中己酸含量的计算见公式（1）

式中：w为白酒中己酸的含量，mg/L；c为样品中己酸的测试浓度，mg/L；V1为吸取样品量，mL；V2为定容体积，mL。

1.3.6 数据处理

由HPLC检测得到的数据用Chromeleon 7进行处理。用Excel 2019对数据进行不确定度计算。用Origin 8.5对不确定度分量作图。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源

从数学模型和检测过程分析可知，浓香型白酒中己酸含量不确定度的来源主要分为两大类，第一类为被测量值重复测试导致的A类不确定度，第二类为测试过程中的影响因素导致的B类不确定度，包括标准物质、标准溶液的配制、标准曲线的拟合、样品的前处理以及仪器性能等几个方面，具体如图1所示。

图1 测试过程中不确定度的分量构成Fig.1 Composition of uncertainty component during determination

2.2 不确定度的评定

2.2.1 A类不确定度的评定uA（ref）

在浓香型白酒中己酸含量的不确定度评定过程中，A类不确定度主要是重复性试验引入的。对浓香型白酒样品在重复性条件下进行6次独立实验，其结果如表1所示。

表1 浓香型白酒中己酸含量的重复性实验结果Table 1 Results of repeated experiments for the determination of hexanoic acid content in strong-flavor Baijiu

根据贝塞尔公式法，己酸测定结果的标准偏差（n=6）为：

A类标准不确定度为：

则测量值的相对不确定度为：

2.2.2 B类不确定度

（1）移取样品量引入的相对不确定度u1（ref）

吸取样品量V1=0.1 mL，按照JJG 646—2006《移液器检定规程》[30]的要求计量，所用100 μL移液器的不确定为u=0.7 μL=0.000 7 mL，k=2，按照均匀分布，则：

移取样品量引入的相对不确定度u1（ref）为：

（2）定容体积引入的相对不确定度u2（ref）

在酒样处理中将0.1 mL样品定容至5 mL，V2=5 mL，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器》[28]的要求计量，5 mL容量瓶为A级，其容量允差为±0.015 mL，按均匀分布评定，则：

容量瓶定容引入的相对不确定u2（ref）为：

（3）样品中测试浓度C的相对不确定度uC（ref）

①标准物质含量的相对不确定度uC1（ref）

本试验所用己酸标准品购置于LGC DR.GmbH公司，编号为DRE-C14196000，从标准物质证书查得己酸的纯度为98.55%，不确定度为U=0.44%，k=2，则

所用标准物质的相对不确定度为：

②标准溶液配制的相对不确定度uC2（ref）

a.称量标准物质引入的相对不确定度uC21（ref）

用0.1 mg分度的分析天平，准确称量标准物质0.045 2 g定容至10mL，配制成标准储备液。分析天平的精度为0.1mg，1级合格，最大允许误差为±0.000 5 g，则：

则称量标准物质引入的相对不确定为：

b.配制标准工作溶液的相对不确定度uC22（ref）

用移液器分别量取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL的标准储备液于10 mL的容量瓶，其中0.02 mL和0.1mL用100μL的移液器移取，经校准其不确定为u=0.7 μL=0.000 7 mL，k=2；0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL用1 mL的移液器移取，经校准其不确定度为u=3 μL=0.003 mL，k=2。则：

c.10 mL容量瓶按照JJG 196—2006《常用玻璃量器》[28]计量结果为A级，其容量允许误差为±0.020 mL，则工作溶液定容引起的相对不确定度为uC23（ref）

则标准溶液配制的相对不确定度uC2（ref）为：

③标准曲线拟合的相对不确定度uC3（ref）

采用HPLC对配制的己酸系列标准工作溶液进行检测，每个浓度测定两次，得到相应的峰面积A，用Chromeleon 7软件对测定的结果拟合得到标准工作曲线，其结果如表2所示。

表2 拟合己酸标准溶液浓度-峰面积结果Table 2 Fitting result of concentration-peak area of hexanoic acid standard solution

表3 高效液相色谱仪测定己酸的结果Table 3 Determination results of caproic acid by HPLC

标准曲线拟合的相对不确定度为：

④测试过程中仪器稳定性引入的不确定度uC4（ref）

液相色谱仪按照JJG 705—2014《液相色谱仪检定规程》[31]校准，其整机定量重复性为0.8%，按均匀分布原则其包含因子为，测试时由仪器状态引入的相对不确定度为：

则样品中测试浓度C的相对不确定度为：

综上所述B类不确定度主要由量取样品、样品定容、样品浓度测试三个方面的因素组成，则uB（ref）：

2.3 结果报告

2.3.1 浓香型白酒中己酸测量值的合成标准不确定度uc

浓香型白酒中己酸测量结果的不确定度，主要来源于以上提及的A类不确定度分量和B类不确定度分量。由评定过程可知，各不确定度分量之间相互独立，则相对合成不确定度为：

浓香型白酒中己酸测量值w=2.724 g/L，则合成标准不确定度为：

合成不确定度报告为：w=2.72 g/L，uc=0.09 g/L

2.3.2 浓香型白酒中己酸的扩展不确定度U

取包含因子k=2，U=2×0.09 g/L=0.18 g/L，则报告扩展不确定度为：

在浓香型白酒己酸含量的测定过程中，结果的不确定度主要来源于测量重复性、酒样的稀释与定容、标准物质、标准工作溶液的配制、标准曲线拟合等几个方面，测量的不确定度分量见图2。如图2可知，对不确定度影响最大的因素是标准工作溶液的配制uC2（ref）。从uC2（ref）的计算公式可知，在配制最低浓度的标准溶液时，选用100 μL的移液器量取20 μL的标准溶液定容至10 mL，对此项不确定度的贡献值最大；其次，是选用1 mL的移液器量取200 μL的标准溶液定容至10 mL。这是由于选用的移液器的量程相对于取液量太大，造成其相对不确定度较大。在后续的实验中，可扩大样品的体系，如量取100 μL定容至100 mL、量取1 mL定容至50 mL；或者选取量程与取液量接近的移液器，如量程为20 μL、200 μL的移液器量取相对应的标准溶液，尽可能减少由于标准溶液配制引入的不确定度。此外，标准曲线拟合引入的相对不确定度也较大。由于斜率和截距是由Chromeleon 7根据标准物质的浓度和仪器测得的对应峰面积拟合得到，因此在实验过程中，要尽量保持仪器的稳定状态和较高的灵敏度，以减小测量过程中的不确定度。

图2 测量不确定度分量Fig.2 Determination of uncertainty components

3 结论

通过对高效液相色谱法测定浓香型白酒中己酸含量的不确定度分析可知，测定结果的不确定度主要来源于样品的重复测定A类不确定度、测定过程中样品的量取与定容、标准物质纯度、标准溶液配制、标准曲线拟合以及仪器稳定性等部分。标准溶液配制对合成不确定度的影响较大，在实验中应选取量程合适的移液器、容量瓶，从而降低这一贡献值。此外，在实验过程中要选用校准合格的量具，严格要求实验人员按照标准操作，确保仪器稳定运行，从而保障检测结果的确定性。本文的研究结果可为白酒中乙酸、丁酸、乳酸和戊酸等其它有机酸类含量的测定以及不确定度评定提供参考。