白酒大曲微生物酶系研究进展

申孟林,张 超,王玉霞*,王 娟,蔡 馨,邢 莲,杨 茂

(1.宜宾学院 生命科学与食品工程学院,四川 宜宾 644000；2.西华大学 食品科学与生物工程学院,四川 成都 610039；3.宜宾学院 固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川 宜宾 644000)

中国白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一,是一种以谷物为原料、酒曲为糖化发酵剂、采用双边或固态糖化发酵生产的酯香浓郁的蒸馏酒［1］。我国绝大多数名优白酒都是添加大曲进行发酵。大曲是以小麦、大麦、豌豆等为原料,经过自然接种发酵、含有多种菌群和酶类的起酵剂［2］。大曲既是白酒酿造过程中的重要物质,也是白酒酿造中必不可少的糖化、发酵、酒化剂和生香剂［3］。大曲中丰富的微生物种群及功能酶系,在酿酒体系中自由流通,成为酒体质量、产量的重要保证［4］。

目前,在白酒品质与大曲质量的关系、白酒大曲中酶系等方面的研究,使人们对白酒大曲有了更加深入而具体地认识。对大曲中各种酶类开展广泛地研究,有助于深化对大曲糖化力、发酵力和风味生成相关酶系等方面的认识。目前关于大曲的研究主要集中在特定酶活力测定［5-8］和各类微生物组成分析［9-10］等方面。大曲中微生物种群组成的多样性,使得微生物来源的各类酶系也极为复杂。不同微生物来源的酶以及酶学特性不同,在白酒酿造过程中所起的作用也不尽相同。大曲发酵过程中,一种微生物能够产生多类酶,而一类酶也可以来自不同类别的多种微生物菌群,这就使得大曲中酶的研究,极具挑战性。对大曲中酶类研究较多的有糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等,并以此作为评价大曲发酵性能的重要指标［11-12］。本文阐述大曲中主要微生物类群及酶类研究现状,从而更加准确的调控白酒风味物质及产品品质,在传统工艺基础上,以期为制作更加优质的大曲奠定理论基础,进而提高白酒酿造工艺水平。

1 大曲中微生物分类

大曲是通过自然接种来自原料、培曲环境中各种微生物而发酵制成的,因此大曲中含有极为丰富的微生物菌群,是多种微生物的混合体系,主要包含霉菌、细菌和酵母菌三大类,此外也包含少量放线菌,但其功能尚不明确［13］。

1.1 酵母菌

大曲中的酵母主要包含有酿酒酵母、产酯酵母、假丝酵母等。酵母菌在大曲酒发酵过程中发挥着两个重要作用即酒化与酯化［14］,大曲中酵母属酵母、汉逊酵母能产生具有较强活力的酒化酶,该酶可以使葡萄糖经糖酵解途径(embden meyerhof pathway,EMP)代谢转化为白酒最重要的物质基础—乙醇［15］；产酯酵母主要包括假丝酵母和汉逊酵母,其具有较强的酯合成能力,酯类物质可赋予酒类水果香,其机理已被相关学者所报道［16-17］。李红等［18］从茅台酒厂酿酒车间分离选育出一株高产酒精酵母,拥有较强的发酵力,适合应用于淀粉质原料的酿酒。陈美竹［19］通过对酱香型白酒高温大曲和多轮次酒醅进行研究,其研究结果表明,酱香型白酒生产中的酵母拥有产酒、产香和产多元醇的多种能力。酵母菌在大曲酒酿造过程中既能保证发酵的原动力,也能提供丰富酯类及醇类物质,对酒体的完美与丰满度起着重要作用。

1.2 霉菌

大曲中的霉菌主要有曲霉(黑曲霉、红曲霉、黄曲霉、米曲霉)、根霉、毛霉、头霉、青霉等。由于霉菌形态独特,起初生长最常见的是白或灰白的颜色,随着孢子进一步生长,会出现绿、黄、青、橙等各种颜色,进而形成“五色衣”,生产中常以此作为大曲质量的感官评定的依据［4］。霉菌在大曲糖化力、液化力、酯化力等方面发挥重要作用,其在大曲中的种类、数量对大曲质量起着决定性影响。

黑曲霉是一类重要的工业微生物,在酶制剂、异源蛋白、有机酸等领域应用广泛［20-21］。黑曲霉能产生α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、柚苷酶、果胶酶、单宁酶等［22］。武赟等［23］研究了具有较强的纤维素酶产生能力的黑曲霉,此纤维素酶可以较好地分解原料中大量的纤维素类基质,进而大幅度提高酿酒原料的利用率。红曲霉具有产生多种功能酶的能力,不仅能代谢产生酯化酶,还能产生果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、糖化酶等。周靖等［24］利用传统微生物分离的方法,采用传统微生物分离手段从酱香型大曲内分离出了两株鉴定为红曲霉属的菌株MZ-1和MZ-2,均具有良好的糖化酶及酯化酶活力。不同种类的红曲霉菌株所产酶的类型及产量差别很大,因此在大曲酒酿造过程中具有极高的实用价值。

根霉产糖化酶、液化酶(淀粉酶)能力强,能将淀粉高效率地转化为葡萄糖［25］。根霉属中以米根霉为代表,具有高产糖化型淀粉酶的能力［26］。糖化型淀粉酶能破坏原料中淀粉的α-1,4和α-1,6糖苷键,从而将绝大多数淀粉转变为可发酵性糖(如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等［27］)。除此之外,有学者研究发现,米根霉不仅能在发酵过程中产生大量芳香性成分(如乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇、3-甲基丁醇、乙醛等),米根霉细胞还具有代谢产生乳酸等独特有机酸酶系的能力［28］。然而,在白酒酿造中,大量的有机酸的存在会影响发酵的进程,从而影响大曲酒品质,因此合理控制和利用发酵过程中米根霉生长就变得尤为重要。

1.3 细菌

大曲中的细菌种类较多,较为常见的有醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等。细菌产生的酶类主要有：液化酶、蛋白酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。谢国排等［29］利用热处理、高温培养等方法,从金种子浓香型大曲中分离出6株产蛋白酶的嗜热细菌,通过气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph-massspectrometer,GC-MS)检测其单菌种发酵液中香气成分,发现这些菌株均有产芳香族化合物、酚类、酯类等白酒风味物质的能力。陈晓旭等［30］通过对浓香型大曲中的高液化力菌株进行筛选与鉴定,筛选出一株细菌,该菌株的液化力高达11.756 g/(g·h),该菌株有多种代谢产物：吡嗪类物质、愈创木酚和苯甲醛等多种重要的大曲风味物质。王鑫昕等［31］经试验筛选得到的高产淀粉酶细菌C3-枯草芽孢杆菌,其淀粉酶活力为63.1 U/g,比原厂浓香型大曲提高了44.4%。枯草芽孢杆菌在大曲中的功能较多,赵东等［32］分离自大曲中的产红色素细菌,不但能产生碱性蛋白酶,还具有分泌淀粉酶的能力。枯草芽孢杆菌还是大曲中芳香味物质的主要来源。林群等［33］从大曲中分离得到一株能发酵高梁的枯草芽孢杆菌,经GC-MS分析检测得到了多种芳香族化合物。细菌是生香的主力军,在风味物质形成与酒体风格和质量等方面起着不可或缺的重要作用。

2 大曲中酶系研究现状

一切微生物的生命活动都离不开酶,大曲及酿酒培养各种微生物的目的在于利用微生物产生的酶系进行各类生化反应。由于大曲中微生物的多样性,在大曲培养成熟的过程中微生物可以产酶,并进一步降解发酵时的原料以促进利用［34-35］。大曲中的酶根据催化功能可分为糖化酶、液化酶、蛋白酶、酯化酶、纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶、果胶酶等类别［4］。

2.1 糖化酶

糖化型淀粉酶俗称糖化酶,主要作用于淀粉的非还原性末端,水解α-D-1,4-葡萄糖苷键。糖化酶主要是由根霉、黑曲霉、米曲霉及红曲霉等产生［36-37］。糖化酶在白酒上的应用非常广泛,主要是用作糖化剂,具有提高出酒率、简化操作的优点［38］。鲁珍等［39］从高温酱香白酒大曲中分离了高产糖化酶菌株,其中蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GX06产糖化酶能力最强,糖化酶活性可达917.03 U/g,应用该特性可有效提高原料利用率。杨跃寰等［40］应用传统微生物分离的方法,筛选出具有高糖化酶活力菌株njsys-3与njsys-6,其酶活分别达到1 842 U/g、2 349 U/g。分子生物学鉴定结果表明,菌株nisys-3为棒曲霉、菌株njsys-6为黑曲霉；研究表明,当菌株njsys-3种子液添加量达到6‰时,大曲糖化力提高26.9%；菌株njsys-6种子液添加量达到6‰时,糖化力趋于稳定,提高34.1%左右,且能增加曲香。我国白酒采用传统生产工艺居多,固态体系中的双边发酵微生境条件非常复杂。在影响出酒率的众多因素中,最为重要的是淀粉质原料的利用情况。糖化作为白酒发酵的基础,使得糖化酶活力的高低成为影响出酒率的决定因素之一。

2.2 蛋白酶

蛋白酶是水解蛋白质肽键的酶的总称。依据酶作用的pH不同,可将其大致分为酸性蛋白酶(pH2.5～6.0)、中性蛋白酶(pH7.0左右)和碱性蛋白酶(pH8.0～11.0)。蛋白酶的水解产物主要为氨基酸、多肽,不但为微生物的生长、繁殖提供营养物质,也为其代谢产物提供结构物质［41］。蛋白酶主要是由细菌产生,张海龙［42］通过紫外诱变的方法对出发菌株米曲霉沪酿3.043原生质体进行诱变,经过初筛、复筛等,最终成功选育出一株高活性蛋白酶突变菌株米曲霉TZ-04。

在酿造白酒的过程中,添加适量的酸性蛋白酶,对原料中蛋白质水解,一方面能有效地破坏原料颗粒质间包膜结构,使醪液中可利用糖增加、原料率得到提高；另一方面还能增加醪液中可被酵母利用的有机氮源氨基酸含量,对酵母细胞的快速生长繁殖、酒精产量的提高起到促进作用。通过相关研究发现［41］,在酿制白酒过程中,适量添加蛋白酶能够显著地提高原料利用率和出酒率。以发酵法生产酒精时,选择性地加入一些蛋白酶,可以减少向发酵池中补充麦芽汁的量,从而降低成本。蛋白酶在大曲的培育发酵及白酒的固态发酵过程中,不仅具有提供营养物质供微生物代谢、提高原料利用率和出酒率的作用,还对白酒品质、香气结构产生重要影响。

蛋白酶除在白酒方面的应用,在果酒、啤酒等方面也引起重视,成为研究的热点。在果酒方面,对蛋白酶研究主要集中在葡萄酒方面。张传军［43］通过酶法提高白葡萄酒质量稳定性的研究发现,当蛋白酶量0.6%,pH6.5,温度45℃,反应时间38 h时,白葡萄酒中的蛋白含量降低为0.31 g/L,氨基酸含量升高至6.7 mg/L,可有效减少白葡萄酒中非稳定蛋白含量,从而提高葡萄酒品质。

2.3 纤维素酶

纤维素酶是指能水解纤维素中β-1,4-葡萄糖苷键,将纤维素水解为葡萄糖的一组酶的总称,它不是单一酶,而是拥有协同作用的多组分酶系,在白酒酿造原辅料中含有大量的纤维素类基质,通过纤维素酶的分解作用,可以将这类基质转化为可发酵糖,提高原料中淀粉的利用率,从而提高出酒率。

纤维素酶主要由真菌和细菌产生,中性和碱性纤维素酶多由芽孢杆菌属微生物产生。龚丽琼等［44］从高温大曲中筛选出产纤维素酶的芽孢杆菌,经测定其内切纤维素酶活力和外切纤维素酶活力分别为556.64 U/mL、121.47 U/mL。酶的稳定性实验结果显示,该菌株所产纤维素酶在温度低于60℃、pH4～8时,具有良好的热稳定性和pH稳定性,通过响应面法优化固态发酵产酶培养基,优化后测定纤维素酶活提高至1643.27 U/mL。纤维素类物质在白酒生产的原料和辅料中占主要地位,仅高粱一种原料中纤维素含量为2%～3%,而辅料糠壳中纤维素含量则更高。高粱、小麦等原料中大量的纤维素类基质在纤维素酶的作用之下转化为可发酵性糖,并通过微生物的进一步发酵作用将其转化为酒精,从而提高出酒率和原料的利用率［45］。研究表明［46］,大曲酒糟中添加适量纤维素酶后,在相同工艺条件下发酵2 d,每吨含10%淀粉的酒糟可产出60%vol白酒61 kg,是常规发酵20 d所产酒量(15 kg)的4倍左右,因此,纤维素酶在白酒发酵业中将会有巨大的应用潜力。王传荣等［47］以酒糟为原料,应用纤维素酶、糖化酶和TH-AADY(耐高温酒用活性干酵母)的复合作用,对浓香型大曲酒丢糟进行再发酵,不但显著提高了出酒率,还大大降低了残余淀粉含量,原料利用率得到了明显提升。现如今,纤维素酶的应用仍然不广泛,有以下几点因素制约着纤维素酶的发展：对于纤维素酶在白酒酿造过程中相关添加量较少；纤维素酶整体的产量和活性都不高,若广泛使用,会导致白酒的酿造成本增加；纤维素酶相关的检测技术尚不成熟［53］。因此,纤维素酶的研究和发展将成为未来科研工作者一个主要的方向。

2.4 酯化酶

酯化酶不是酶学上的术语,在白酒生产中是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶的统称。酯化酶在白酒生产过程中具有使醇与酸脱水缩合生成酯的催化作用。大曲中酯化酶在白酒酿造过程中发挥着巨大的作用,可以催化醇与多种酸的酯化,如乙醇与己酸、乙酸、乳酸、丁酸等反应,生成的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等,进而形成白酒的主要香气成分。王晓丹等［54］利用红曲霉FBKL3.0018制成的酯化酶粗酶制剂,加入浓香型清酒发酵中,当用曲量减少2%～5%,出酒率提高约2%；通过对微量成分含量进行分析,白酒质量得到明显提高。细菌、真菌、霉菌都具有产生酯化酶的能力,因此筛选高产酯化酶的菌株将其用到发酵中或者以复合酶菌剂用于白酒酿造过程,可以显著提高出酒率和优质酒率。

酯化酶技术的应用是中国白酒工业的一项重大创新成果,酯化酶制剂在白酒生产中被广泛应用,虽然酯化酶技术已经日趋成熟,但仍存在以下几个方面的问题：微生物选育方面应筛选出适应强较强、不易变异、产酯、产香风格更为突出的菌株,进而形成香气更加浓郁,风格更加迥异的优质白酒,以满足市场需求；酯化酶的纯度及活性需要进一步提高,并且目前大部分酶制剂研究仍处于粗酶制剂阶段,纯度不高。从酶制剂的纯度进行研究,形成产业化规模,从而满足白酒市场需求,提高优质酒率［55］。

3 结论与展望

近年来,对白酒大曲的研究日益深入,对大曲整体的认识也得到进一步加深,大曲中所含酶系的种类和数量繁多,其相互之间作用关系复杂。近年来,众多研究机构与学者基于大曲液化力、糖化力和出酒率的直接关系,对大曲的糖化型淀粉酶和液化性淀粉酶研究有了较大收获,但在白酒发酵复杂多变的多菌多酶体系中,对白酒发酵酶和酶类系统的深入研究还比较少。大曲在白酒酿造过程中发挥的重要的作用,其实质是大曲中丰富的微生物群体利用自身酶系,进行底物催化的一系列反应。大曲发酵过程中,曲房内环境条件以及曲块内微生态环境的变化,决定了大曲中微生物竞争更迭的菌群和酶系。大曲内丰富的微生物群及其功能酶系在酿酒的三系(菌系、酶系、物系)中流通,所包含的菌种丰度、协调性及在制曲过程中形成的风味前驱物质,是酒体质量和产量的重要保障。大曲中酶系之间相互作用影响着原料的利用率和出酒率,其重要作用最终体现在白酒的品质和风格。

本文概述了大曲微生物分类,以及大曲中主要酶系的功能及作用。通过研究大曲微生物分类以及产酶情况,揭示微生物之间相互活动的内在规律,达到突出特殊风味和提高特定产品风格及质量的目标。通过对大曲酶系中酶的种类和数量进行优化组合,以特定白酒风味为导向的酿造工艺探索和创新,有望成为今后我国传统工艺白酒生产研究的重点和努力方向。目前研究主要集中于微生物筛选及其酶活力研究,但对其实际应用研究相对较少,有待于对应用微生物学和工程学等学科中多种原理进行深入研究,进一步揭示我国白酒固态发酵的奥秘。

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《中国酿造》创刊于1982年,是由中国商业联合会主管,中国调味品协会及北京食品科学研究院主办的综合性科技月刊(国内统一刊号CN 11-1818/TS,国际标准刊号ISSN 0254-5071,广告许可证号：京宣工商广字第0033号)。全国各地邮局均可订阅,邮发代号：2-124；国外总发行：中国国际图书贸易总公司,国外发行代号：BM1437。《中国酿造》历次被评为全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、《中国知网》重点收录期刊、《万方数据库》全文收录期刊、《中文科技期刊数据库》来源期刊、中国学术期刊网络出版总库收录期刊、美国《乌利希期刊指南》(UPD)收录期刊、英国《食品科学文摘》(FSTA)收录期刊、英国《国际农业与生物科学研究中心》(CABI)收录期刊、美国《化学文摘》(CA)收录期刊、俄罗斯《文摘杂志》(AJ)收录期刊、中国科学评价研究中心(RCCSE)数据库收录期刊,也是学位与研究生教育的中文重要期刊。

《中国酿造》重点报道调味品、酿酒、食品微生物、食品添加剂、发酵乳制品、生物工程技术、生物化工、生物质能源的开发利用等研究方向的新工艺、新技术、新设备、分析检测、安全法律法规及标准、保鲜与贮运技术、综合利用、质量保障体系等方面的基础理论、应用研究及综述文章。设有“研究报告”、“专论综述”、“创新借鉴”、“经验交流”、“分析检测”、“产品开发”、“酿造文化”、“海外文摘”等栏目。

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