枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的研究进展

张晓燕,国立东,刘晓艳*

(黑龙江中医药大学 药学院,黑龙江 哈尔滨 150040)

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类革兰氏阳性、好氧型细菌,具有单层的细胞外膜,细胞壁不含内毒素,菌体呈污白色或微黄色,表面粗糙能够形成孢子,无荚膜,周生鞭毛,能运动。枯草芽孢杆菌在自然界分布广泛,已有研究报道在食品［1］、土壤［2］、海洋［3］、植物［4］及动物肠道［5］等环境中分离到枯草芽孢杆菌,因对环境适应性强、发酵工艺简单、对人畜无毒无害,成本低、环保等特点,先后被美国食品药品监督管理局和我国农业部规定为安全菌种,广泛应用于食品、饲料、医药、酶制剂等工业生产。枯草芽孢杆菌属于益生菌,具有改善动物消化道微生物群结构、提高免疫力、促进生长发育、提高生产性能的生理学功能［6-7］,并且对植物生长也具有促进作用［8］。在医药领域,枯草芽孢杆菌可改善脂代谢平衡、缓解氧化压力［9］,可用于发酵中药药渣促进其生物活性成分的释放,为中药药渣的高值化利用提供新途径［10］。此外,枯草芽孢杆菌因其高蛋白酶活性而广泛用于改善饲料品质［11-12］。据不完全统计,来源于枯草芽孢杆菌的酶制剂占整个酶市场的50%［13］,其中应用最广泛的是蛋白酶,蛋白酶根据最适pH值不同分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中,中性蛋白酶最早用于工业生产,其作为一种工业酶制剂使用时,与化学试剂相比具有作用条件温和、催化反应速度快、无工业污染等优点。本文着重对枯草芽孢杆菌所产中性蛋白酶的相关研究进行简要综述,以期为其深入研究提供参考。

1 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的特性

中性蛋白酶是能够在中性以及弱酸或弱碱条件下催化蛋白质肽键水解成小分子肽的一类蛋白酶,其最适作用pH值为6.0～7.5。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶按活性中心划分属于金属蛋白酶,其酶活性大都依赖于某种二价金属阳离子(如Zn2+、Ca2+、Mg2+等),这些金属离子对酶起激活或保护作用,而某些非依赖性阳离子会抑制酶活性［14］,金属螯合剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetieacid,EDTA)、乙醇、异丙醇等化学试剂也会抑制酶活性。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的酶活、性质和产量主要受其菌种来源、菌种选育以及发酵培养条件等因素的影响。不同来源的枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的能力不同,所产中性蛋白酶在稳定性、耐热性、耐受性以及对蛋白质的水解能力等方面也存在差异。此外,枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在酶促反应中的活性还会受到作用环境酸碱度和温度的影响［15-16］。如枯草芽孢杆菌1398中性蛋白酶在pH 7～8之间均具有活性,且在环境pH值为7.6时酶活性最大,并且在一定范围内酶活性会随着温度的升高而增大,当达到某一临界值时酶活性最高,之后继续升高温度酶活性急剧降低［17］。枯草芽孢杆菌不同代表菌株的中性蛋白酶特性如表1所示。

表1 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的特性Table 1 Characteristics of neutral protease from B.subtilis

2 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的应用

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶制剂为一种天然生物制剂,与化学添加剂相比,其对人和动物更加安全可行。其主要应用在如下行业中。

2.1 食品行业中的应用

可用于肉类鲜化、啤酒酿造、果汁、烤焙等食品工业,从而改善食品的味道、品质、稳定性和安全性［14］。由于中性蛋白酶可以水解蛋白质,所以常被应用于啤酒和各种茶类饮品的澄清,也能够水解肌原纤维和弹性蛋白使肉类得到鲜化,在烘焙食品时加入枯草芽孢杆菌中性蛋白酶可提升面团的柔韧性和延伸性。

2.2 饲料行业中的应用

枯草芽孢杆菌具有增强动物免疫功能、拮抗致病微生物等作用,是经我国农业部认定的2种饲料添加菌种之一。中性蛋白酶可用于动物饲料的生产,减少饲料中抗营养因子的不良影响,促进动物消化道对营养物质的吸收进而有助于动物生长［22］。

2.3 医药行业中的应用

近年来,中性蛋白酶在医药领域的应用也逐渐增多,主要利用其消炎、抗肿胀、利胆、止痛助消化的功效,其消炎止痛作用比一般的抗生素和镇痛剂更强［23］。在皮肤病治疗和化妆品研发中应用中性蛋白酶能够加强皮肤新陈代谢,去除老化角质、减少青春痘形成［24］。在临床通过胰岛移植治疗I型糖尿病过程中,将中性蛋白酶与另外两种胶原酶共同作用,能够促进于人体胰岛与胰腺的分离［25-26］。另外,中性蛋白酶的固定化可应用于制备抗癌制剂的中间体［27］。目前,利用蛋白酶水解动物蛋白制备生物肽的研究也较为活跃,研究人员采用中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白［28］和鲐鱼多肽［29］成功制备了抗氧化肽,结果显示中性蛋白酶为最佳水解酶。

综上所述,中性蛋白酶的应用已经渗透到生活的诸多方面,并且该类研究仍在继续,日后必将在更多的领域发挥其有益作用。

3 提高枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力的途径

在一般情况下从自然界经过简单的分离筛选所得到的枯草芽孢杆菌虽然拥有了一定的产酶能力,但不能满足规模性工业生产的要求,需要通过微生物菌种选育途径和发酵工艺条件优化两者结合提高酶的活力。

3.1 育种途径

(1)诱变育种

诱变技术包括传统诱变技术和复合诱变技术。传统诱变技术根据诱变剂的不同分为物理诱变、化学诱变和生物诱变,原理是通过作用于细胞中的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)使其结构发生变化,引发诱变,进而从大量变异菌株中选取优良性状的突变株。传统诱变工作量较大,突变类型少,达不到预期诱变效果,因此在育种工作中常使用两种或两种以上的手段进行复合处理发挥协同作用提高诱变效应。研究人员应用紫外线、微波以及亚硝酸盐处理等传统诱变方法对枯草芽孢杆菌N19进行复合诱变,所得突变菌株UMN-26的中性蛋白酶产量较出发菌株提高了4倍,酶活性由158 U/mL增长至803 U/mL,且突变菌株表现出良好的遗传稳定性［18］。游玟娟等［19］以枯草芽孢杆菌As1.398为出发菌株,利用紫外线与亚硝酸复合诱变处理,用30W紫外线照射处理出发菌株60s筛选出诱变效果好的菌株,再用0.15 mol/L的亚硝酸处理20 min筛选得到稳定突变株UN-11,所产中性蛋白酶活性可达2665.2U/mL,比出发菌株提高了75.3%。可见复合诱变是提高微生物产中性蛋白酶活力的有效途径。目前,枯草芽孢杆菌诱变育种产中性蛋白酶的研究重点是通过诱变对菌株进行改良,突破或解除其原有代谢调控,使得所需代谢产物中性蛋白酶足量积累,进而实现优质、高产、低耗和高效转换。

(2)基因工程育种

1983年,嗜热脂肪芽孢杆菌源中性蛋白酶的编码基因首次被克隆并表达于枯草芽孢杆菌中［30］,自此开启了中性蛋白酶的基因修饰研究。枯草芽孢杆菌可以表达和分泌两种中性蛋白酶(即A和B),其中A为主要的中性蛋白酶。编码中性蛋白酶A的基因为nprE,位于基因组1 530.127～1 550.127 kb之间,基因编码序列全长1 563 bp,能够编码521个氨基酸残基的多肽［31］。WANGH等［32］从解淀粉芽孢杆菌K11菌株中克隆到中性蛋白酶编码基因,应用难转化菌株的特异性遗传操作方法,在枯草芽孢杆菌WB600菌株中构建重组质粒,在优化条件下转化菌株K11,通过优化其发酵条件使菌株转化体110N-6具有高活性和优异的遗传稳定性。张敏等［33］利用sac B诱导基因和枯草芽孢杆菌蛋白酶双缺陷突变株DB104构建了一个对中性蛋白酶基因进行诱导表达的系统,以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题,从而实现中性蛋白酶基因的高效表达,以大幅度地提高中性蛋白酶的产量,降低其生产成本。

(3)空间育种

微生物空间诱变育种的原理是利用卫星、飞船等返回式航天器将筛选好的部分微生物带到宇宙空间,在辐射、微重力、高真空、交变磁场等太空诱变因子的作用下,菌种发生遗传性变异,经空间诱变育种一定周期后返回地面进行比较和筛选,我国利用神舟五号宇宙飞船和第22颗返回式卫星搭载枯草芽孢杆菌BS2进行首次重复空间诱变,返地后筛选中性蛋白酶高产菌株,获得了菌株BSK-8,其中性蛋白酶活性比原始菌株提高了6.9倍,且产酶稳定［34］,这一研究表明,空间育种可以作为枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶育种的一种有效诱变途径。

3.2 发酵工艺条件的优化

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性、稳定性、耐热性等性质决定其应用范围,这些特性受培养基组分和发酵条件的影响。目前对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化首先通过单因素试验确定最适培养基组分,再经正交试验或响应曲面分析等优化方法快速有效地确定发酵工艺中多因子系统的最佳条件［18,20,35-36］。刘颖等［20］通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株进行产酶优化,结果表明其最适培养基碳源、氮源、无机盐的种类及添加量为：麦芽糖8.0%,蛋白胨4.0%,MgSO40.08%；最佳发酵条件为：温度37℃,初始pH值7.0,发酵时间42 h,最优条件下中性蛋白酶酶活由最初的98.36 U/mL提高至353.45 U/mL。王东等［35］通过单因素试验确定了一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌的最适培养基的碳源、氮源、无机盐和表面活性剂分别为：蔗糖、牛肉膏、CaCl2、吐温-80；在此基础上,通过Plackett-Burman试验设计和响应曲面分析优化得出最佳培养条件为：蔗糖3%,牛肉膏2%,CaCl20.3%,吐温-800.55%,发酵温度37℃,初始pH值7.5,发酵时间50.4 h,接种量2.66%,最优条件下所产中性蛋白酶酶活为143.54 U/mL,较原来提高了1.3倍。马宏颖等［18］通过摇瓶发酵试验确定枯草芽孢杆菌UMN-26的最佳发酵工艺为摇床转速240 r/min,发酵培养基起始pH 6.5,接种量2.5%,发酵温度37℃,发酵时间32 h,在此条件下发酵培养所产中性蛋白酶活力可达1378 U/mL,是优化前的1.7倍。由此可知,枯草芽孢杆菌所产中性蛋白酶活性,主要受碳源、氮源、无机盐离子、表面活性剂等培养基组分,以及发酵温度和时间、环境酸碱度和接种量等条件的影响。

4 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的分离纯化

现有蛋白酶的分离纯化方法分为三类［37］,即沉淀法(包括有机溶剂沉淀法、盐析沉淀法、等电点沉淀法、热变性沉淀法)、层析法(包括分子层析法、离子层析法、亲和层析法)以及膜超滤法。

沉淀法是较为传统的蛋白酶初步分离纯化方法,其中有机溶剂沉淀法具有分辨率高、溶剂易除去的优点,但容易破坏蛋白质的氢键,引起蛋白酶变性失活,其中在常用的有机溶剂中丙酮的沉淀能力较强［38］。相比之下,盐析沉淀法作用比较温和不易引起酶的变性失活,常用分段盐析的方法反复进行沉淀来提高纯化倍数,常选用的中性盐是硫酸铵,盐析沉淀法缺点是大量的盐析剂会滞留在沉淀物中并伴有硫酸铵恶臭气味。等电点沉淀法是通过将溶液的pH值调节到蛋白酶的等电点,减小溶液静电荷从而达到分离的效果,操作较简单且便于控制,但由于某些蛋白酶的等电点相差不大而使得分离的蛋白酶纯度低。热变性法是利用酶的热稳定性不同,通过控制温度分离不同种类的蛋白酶,方法操作简单,但过程不易控制容易导致酶失活变性。

层析法被广泛应用于蛋白酶的进一步分离纯化,其中分子筛层析适用于含有不同分子大小的混合物分离,方法操作简单迅速且对蛋白酶活性影响不大,但分辨率低。离子交换层析与分子筛层析相比特异性更高,可通过设置参数提高纯化效率,但大量酸碱的使用会对环境造成危害。亲和层析法是较上述两种层析法更为高效的蛋白酶纯化法,是通过在层析柱中放置具有特殊结构的亲和分子固相吸附剂,从而分离有亲和力的蛋白质,再用洗脱剂进行洗脱分离结合的蛋白酶,但有时会因为分子的错误识别而吸附杂蛋白,且费用较为昂贵。

膜超滤法是利用膜的选择性,以压力差为推动力实现蛋白酶的分离。膜的原料多为醋酯纤维等高分子材料,超滤过程中不会引起蛋白酶活性的改变,不需热处理故对热敏性蛋白酶也较为安全,且滤膜可多次循环利用,但该方法使用必备条件是待分离的两种产品分子质量相差5倍或5倍以上。

鉴于现有蛋白酶分离纯化方法都存在各自的优势与不足,故在酶的纯化过程中通常是采用上述几种有效方法进行组合并用以达到最佳的纯化效果。赵忠润等［15］考察了离子交换树脂层析和工业级吸附型大孔树脂纯化枯草芽孢杆菌1398中性蛋白酶的效果,发现离子吸附纯化能够完全去除色素和异味物质,树脂吸附也可以达到实验室级预装柱的分离效果。赵丛等［16］将含有杂蛋白的ZC-7中性蛋白酶通过硫酸铵盐析分级分离,除杂后的蛋白酶经过离子交换层析和凝胶层析纯化,获得了凝胶电泳条带单一的蛋白样,纯化倍数为77.5。

5 结论

枯草芽孢杆菌在产酶工业上的应用日渐增多,尽管国内外对中性蛋白酶的研究相对较多,且其在工业上的应用也日益广泛,涵盖了食品、饲料、医药等领域,但相比于其他蛋白酶,中性蛋白酶活力相对较低,提高枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力仍是将来研究的重中之重,为了提高中性蛋白酶产量与活性,可以通过传统诱变育种、基因工程育种甚至空间育种的方式,并结合优化发酵培养基组分与发酵条件的手段实现。此外,关于枯草芽孢杆菌所产中性蛋白酶的结构鉴定及其发挥酶活性的具体作用机制研究不够深入,相关研究鲜有报道。随着枯草芽孢杆菌遗传信息的揭示以及蛋白质组学、代谢组学技术的发展与成熟,枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的生物学特性以及作用机制将被逐渐明确。

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