茅台大曲中一株嗜热放线菌的分离筛选及特性研究

王晓丹,罗小叶,邱树毅*

(1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳 550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州 贵阳 550025)

茅台大曲是一种高温大曲,是通过传统固态发酵的方法,在65℃条件下,用小麦加母曲经过60 d的发酵自然形成的一个含有多种微生物体系的发酵制品［1-3］。由于多种微生物富集在大曲里且在制曲过程中自然生长起来,因此,整个大曲微生物复杂而多样。目前,本课题组前期已经采用纯培养技术及分子生物学手段对茅台大曲中的细菌、霉菌及酵母菌进行了深入的研究,证实了茅台大曲中细菌的生香动力、霉菌的糖化主力及酵母的酒醅发酵原动力的作用,诠释了茅台大曲中微生物在大曲酒的品质及风味呈现方面的重要作用［4-6］。

放线菌是大曲“菌系”中的一类具有较高鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的革兰氏阳性细菌,其能产生丰富的活性次生代谢产物,是一种重要的微生物类群。在传统白酒生产领域有关放线菌的研究主要集中在白酒发酵过程中酒醅、大曲、窖泥、发酵池、曲房和窖房空气中放线菌的分离及鉴定［7-9］,并对其酿造相关的放线菌挥发性物质及代谢酶活性进行了研究［10-11］。同时,放线菌作为抗生素的主要生产菌株,在其他领域的研究较为深入；但作为白酒酿造的四大菌类之一,其某些独特的代谢产物具有土味等特征,在白酒酿造过程中影响着酒体的风味及风格；然而,相对于其他三大类微生物,放线菌在白酒酿造过程中的作用还没被引起足够的重视［12］。目前,研究人员仅对茅台大曲生产过程中周围土壤及糟醅中的放线菌进行了研究［13］,对茅台大曲中放线菌的种类及功能鲜有研究报道。

本研究建立了一种有效的高温放线菌分离筛选方法,通过形态学、生理生化及26SrDNA分子生物学对筛选的高温放线菌进行了鉴定,并采用大曲酶系酶活力测定方法对其酶活性质及通过固态微萃取与气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometer,GC-MS)技术对发酵代谢产物成分进行了分析,为了解放线菌在茅台大曲中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

茅台大曲来源于贵州茅台酒股份有限公司的茅台酒车间生产用高温大曲,产地位于黔北遵义地区赤水河畔的茅台镇(东经106°22′、北纬27°51′、海拔423m)。大曲样品为已经在车间贮存半年且准备用于生产的已经粉碎成20目的曲粉,在混合好的曲粉袋中按上、中、下层分别随机取20个样品,再经过充分混合后,迅速放入无菌保鲜袋中,于4℃冰箱中保存备用。

1.1.2 化学试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒：美国BIOMIGA公司；萘啶酮酸、制霉菌素：上海源叶生物科技有限公司；新生霉素：北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均国产分析纯。

1.1.3 培养基

分离培养基采用高氏一号培养基(M1)、ISP2培养基(M2)、ISP3培养基(M3)、ISP4培养基(M4)、ISP5培养基(M5)、R2A培养基(M6)、淀粉-甘油培养基(M7)、GYM培养基(M8)、GTY培养基(M9)、HV培养基(M10)：实验室自制。

纯化及菌种保藏培养基采用ISP2培养基：分别称取酵母提取物4 g,麦芽提取物1 g,葡萄糖4 g及琼脂15 g,用1 L蒸馏水溶解,然后用5mol/LNaOH溶液调pH值为7.3,121℃灭菌20 min。

液体发酵培养基：葡萄糖10 g、酵母膏4 g、蛋白胨4 g、酵母浸粉4 g、K2HPO44 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g,用1L蒸馏水溶解,然后用5mol/LNaOH溶液调pH值为7.2～7.4,然后121℃灭菌20 min。

酶活力测定培养基采用麸皮培养基：称取麸皮15 g,用15 mL蒸馏水搅拌均匀,然后121℃灭菌20 min。

固态发酵产香培养基：将粉碎的高粱与未粉碎的高粱按质量比为3∶1进行混合,然后将混合的高粱与粉碎的小麦按质量比为1∶1进行混合,加入40%的水混合均匀,润粮24 h后用瓶进行分装(50 g/瓶),用8层纱布进行封口,121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

库尔特BECKMAN离心机：美国贝克曼库尔特中国有限公司；Flex cycler多功能聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)仪：德国耶拿分析仪器股份公司；DYCP44P电泳仪：北京欣惠泽奥科技有限公司；ZF25凝胶成像仪：上海方畦仪器有限公司；S3400N扫描电镜：日本日立有限公司；FD-1C-80冷冻干燥机：上海乔跃电子有限公司；HP6890/5975C气质联用仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 筛选方法

(1)样品预处理

干热处理(A1)：用灭菌的烧杯称取10g茅台大曲样品,然后将烧杯封口并置于100℃烘箱中加热1 h；最后将大曲样品放入含有90mL无菌稀释液并带有玻璃珠的三角瓶中,然后50℃、200 r/min振荡培养30 min备用；湿热处理(A2)：称取10 g茅台大曲样品放入含有90 mL无菌稀释液并带有玻璃珠的三角烧瓶中,将三角烧瓶置于50℃、200 r/min的恒温水浴锅中振荡培养30min；先干热后湿热处理(A3)：经干热处理的茅台大曲样品悬浮液在50℃恒温水浴锅中热处理10 min；CaCO3富集培养(A4)：按照大曲样品与CaCO3质量比为10∶1的比例在无菌烧杯中混合,添加适量无菌水,在湿度为30%、温度为28℃的培养箱中培养7 d,然后放入含有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,将三角烧杯置于50℃、200 r/min的恒温水浴锅中振荡培养30 min后备用；先CaCO3富集培养后再进行湿热处理(A5)。

(2)分离培养基的选择

在45～60℃温度下,比较5种预处理方法的样品在10种分离培养基上的生长状况。

(3)筛选温度的设置

分离筛选温度分别设置为45℃、50℃、55℃及60℃。

(4)稀释液的筛选

分别选择无菌生理盐水(质量浓度为9 g/L)及羧甲基纤维素钠(carboxyl methyl cellulose-Na,CMC-Na)水溶液(质量浓度为2.5 g/L)作为稀释液［15］。

(5)抑制剂的添加

用0.1 mol/L NaOH溶液将萘啶酮酸配制成质量浓度为50 mg/L(A1)、100 mg/L(A2)及150 mg/L(A3)的溶液；用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液将制霉菌素配制成质量浓度为20mg/L(B1)、40mg/L(B2)及60mg/L(B3)的溶液；用无菌水将新生霉素配制成质量浓度为30mg/L(C1)、40 mg/L(C2)及50 mg/L(C3)的溶液；用无菌水将重铬酸钾配制成质量浓度为25 mg/L(D1)、50 mg/L(D2)及75 mg/L(D3)的溶液。同时,抑制剂均用0.22μm的无菌滤膜过滤,然后加入到灭菌培养基中混匀,倒入培养皿中［16］。其中,抑制剂的添加组合如表1所示。

表1 抑制剂的添加组合Table 1 Adding combination of inhibitors

(6)分离涂布的方法

称取10g茅台大曲样品加入到含有90mL无菌稀释液并带有玻璃珠的三角烧瓶中,将三角烧杯置于28℃、200r/min的恒温水浴锅中振荡培养30 min。然后取1 mL上述样品悬浮液进行10倍梯度稀释,分别取0.2 mL各稀释度菌悬液涂布于分离培养基上,将培养基置于45℃、50℃、55℃及60℃培养箱中倒置培养,并进行分离纯化,分离得到的菌株用ISP2培养基斜面培养,并在4℃冰箱中保藏备用。

1.3.2 菌种的鉴定

(1)形态培养特征观察

菌株的培养特征观察参照国际链霉菌计划(international streptomyces project,ISP)中有关放线菌的培养特征进行观察［17］。

(2)扫描电镜观察

用液体培养基发酵培养48 h后,离心后弃上清,加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer solution,PBS)(分别称取2.6g NaH2PO4·H2O及29 g Na2HPO4·12H2O,用500 mL蒸馏水溶解)洗涤菌体3次；向菌体沉淀中加入2.5%戊二醛固定液1.5 mL,4℃固定过夜；用30%、50%、70%、90%的叔丁醇/乙醇混合液进行脱水,每次5 min,再用100%叔丁醇脱水2次,每次5 min；然后冷冻干燥4 h,干燥后的粉末样品镀金膜,用扫描电镜进行观察［18-19］。

(3)生理生化特征鉴定

对放线菌进行明胶液化实验、淀粉水解实验、碳源利用实验、纤维素分解实验、硝酸盐实验及牛奶凝固与胨化实验,并参照《链霉菌鉴定手册》推荐的标准培养基和常用生理生化方法培养、观察和记录［14］。

(4)分子生物学鉴定

采用细菌基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取试剂盒进行DNA提取,以F(5‘-CCTACGGGAGGCAGCAG-3‘)及R(5‘-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3‘)为引物进行PCR扩增,PCR扩增程序为94℃预变性5min,然后94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,共30个循环,最后72℃延伸9 min；取2μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测DNA提取效果；PCR产物在上海立菲生物工程技术服务有限公司进行测序；将测序数据在美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)数据库中进行同源序列搜索,用MEGA 5.05软件进行多序列比对,然后用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树。

1.3.3 放线菌粗酶液的制备及酶活力的测定

(1)粗酶液的制备

用接菌环取两环活化的菌株接种到液体发酵培养基中,45℃培养2 d,然后以10%的接种量接种到麸皮培养基中,再45 ℃培养5 d,所得培养物与水按照1∶10(g∶mL)的比例混合搅匀,40℃水浴1 h,每隔15 min搅拌1次,最后进行过滤,所得滤液为粗酶液。

(2)酶活力的测定

糖化型淀粉酶与纤维素酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法；酸性蛋白酶活力的测定根据商业行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》中的方法进行测定；脂肪酶活力的测定根据国标GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》中的动态滴定法进行测定；果胶酶活力的测定根据轻工业行业标准QB 1502—1992《食品添加剂——果胶酶制剂》中的方法进行测定。

糖化型淀粉酶酶活定义：在40℃、pH4.6条件下,1h水解淀粉产生1 mg葡萄糖作为一个酶活力单位。纤维素酶酶活定义：50℃条件下,1 min催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位(U/g)。蛋白酶酶活定义：在40℃条件下1 min水解酪蛋白产生lμg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位(U/g)。脂肪酶酶活定义：1mL酶液在40℃,pH7.5条件下,1 min水解底物生成1μmol可滴定的脂肪酸为一个酶活力单位(U/g)。果胶酶酶活定义：1 mL酶液在50℃、pH3.5的条件下,1 h分解果胶产生l mg半乳糖醛酸为一个酶活单位(U/g)。

1.3.4 放线菌固态发酵产物的香气成分测定

放线菌固态发酵产物的香气成分测定采用气质联用法。用接菌环取两环活化的菌株接种到液体发酵培养基中,45℃培养2 d,以10%的接种量接入高粱与小麦固体发酵培养基中,再45℃培养7 d。均匀取样品约10 g,置于50 mL固相微萃取仪采样瓶中,插入手动进样器,在50℃左右萃取40min后取出,快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250℃)中,热解吸3 min后进样。气相色谱条件：色谱柱为Zebron ZB-5MSI弹性石英毛细管柱(30cm×0.25mm×0.25μm),柱温为40℃,保留时间为2 min,以5℃/min升温至270℃,运行时间为48 min,汽化室温度为250℃,载气为高纯He(99.999%),柱前压为7.62 psi,载气流量为1 mL/min,不分流进样,溶剂延迟时间为1 min。质谱条件离子源为电子电离(electronic ionization,EI)源,离子源温度为230℃,四极杆温度为150℃,电子能量为70eV,发射电流为34.6μA,倍增器电压为1 294 V；接口温度为280℃,质量范围为20～450 amu。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对NIST2005和Wiley275标准质谱图,确定挥发性化学成分,用峰面积归一化法测定各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 分离筛选条件的确定

在45～60℃条件下比较了5种预处理方法处理的样品在10种分离培养基上的生长状况,结果见表2。由表2可知,使用ISP2培养基(M2)、R2A培养基(M6)、GYM培养基(M8)及GTY培养基(M9)为分离培养基,样品用A5预处理方法,羧甲基纤维素钠(carboxyl methyl cellulose-Na,CMC-Na)作为稀释剂,B1C1组合为抑制剂,在45℃及50℃温度下,均能生长出具有细菌或放线菌形态特征的菌落。说明Ca2+对稳定酶的结构和耐高温都有重要作用,且湿热处理能够有效促进嗜热放线菌孢子的萌发［20］；同时,由于羧甲基纤维素钠水溶液具有较好的悬浮作用,并且其稳定性好、无毒,在食品领域常被作为分散剂使用［21］,因此,在分离放线菌时羧甲基纤维素钠是一种有效的稀释剂。同时,B1C1抑制剂组合的分离效果优于萘啶酮酸和制霉菌素组合的分离效果。

表2 预处理方法的选择Table 2 Selection of pretreatment methods

2.2 分离菌株的鉴定

从茅台大曲中分离纯化出1株具有放线菌菌落形态特征菌株,本实验室保藏编号为FBKL4.004。该菌的筛选方法：预处理方法为A5,稀释剂为CMC-Na,分离培养基为GTY培养基,抑制剂为B1C1,培养温度为45℃及50℃。对菌株FBKL4.004进行形态学特征、生理生化实验及分子生物学鉴定。

(1)形态学特征

菌株FBKL4.004菌落形态及扫描电镜结果见图1。由图1a可知,菌株FBKL4.004单菌落形状为圆形,基内菌丝为棕黄色,气生菌丝为灰白色,菌落平坦、干燥致密,且无可溶性色素产生。由图1b可知,通过扫描电镜观察FBKL4.004的特征,菌株FBKL4.004菌丝细长,有直链状的孢子,孢子未分散,菌丝表面有附着物。

图1 菌株FBKL4.004菌落形态(a)及扫描电镜图(b)Fig.1 Colonial morphology(a)and scanning electron microscope(b)of strain FBKL4.004

(2)生理生化特征

菌株FBKL4.004的生理生化试验包括明胶液化、淀粉水解、碳源利用、牛奶凝固与胨化、纤维素分解等,结果见表3。

表3 菌株FBKL4.004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical properties of strain FBKL4.004

由表3可知,菌株FBKL4.004能利用碳源范围较广,葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、棉子糖等均能利用,能使淀粉水解和纤维素分解,明胶液化实验中使明胶凝固,使牛奶酶凝产酸。

(3)分子生物学鉴定

图2 菌株FBKL4.004 16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of strain FBKL4.004

图3 菌株FBKL4.004的16S rDNA基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain FBKL4.004 based on 16S rDNA gene sequence

以放线菌株FBKL4.004基因组DNA为模板进行PCR扩增,其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可知,菌株FBKL4.004PCR扩增结果在400bp处出现明显条带。基因序列测定后,测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索(BLAST),用MEGA5.05软件进行多序列比对,邻接(NJ)法构建系统发育树,结果见图3。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》、《链霉菌鉴定手册》,结合菌株FBKL4.004形态、生理生化特征及分子生物学比对分析,菌株FBKL4.004与Streptomyces bangladeshensis(NR043164)聚为一类,其同源性为98%,因此将菌株FBKL4.004鉴定为Streptomyces bangladeshensis。该菌于2005年首次从孟加拉国纳托尔的土壤中分离到,被归类到链霉菌属的一个新物种,其16SrRNA比对分析与嗜热链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)有较高的同源性［22］,对革兰氏阳性菌及某些致病真菌有抗菌活性［23-24］,具有生物降解聚(β-羟基丁酸酯)的作用［25］。

2.3 放线菌的产酶特性

酱香大曲的酶系主要有液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶、果胶酶、酯化酶及漆酶等酶类。本研究对嗜热放线菌(Streptomycesbangladeshensis)FBKL4.004在酿造过程中产生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、糖化酶及纤维素酶的活性进行了研究,结果见表4。由表4可知,各种酶的酶活力差异较大,其中酸性蛋白酶和纤维素酶的酶活比较低,分别为3.34 U/g、2.07 U/g,产糖化酶及果胶酶活力最高,分别为345.03 U/g及318.57 U/g。

表4 菌株FBKL4.004酶活力测定结果Table 4 Determination results of enzyme activity from strain FBKL4.004

2.4 放线菌固态发酵香气成分分析

图4 菌株FBKL4.004固态发酵产物挥发性成分总离子流色谱图Fig.4 Total ions chromatogram of volatile compounds of strain FBKL4.004 solid-state fermentation

对从茅台大曲中分离得到的嗜热放线菌株FBKL4.004进行了固态发酵,并通过固态微萃取与气相色谱-质谱联用技术对其挥发性成分组成及风味成分进行了测定,总离子流色谱图结果见图4,各香气成分鉴定结果见表5。

表5 菌株FBKL4.004固态发酵产物挥发性成分组成分析结果Table 5 Analysis results of volatile components in strain FBKL4.004 solid-state fermentation products

由表5可知,嗜热放线菌FBKL4.004固态发酵代谢产物种类丰富,主要以酯类物质为主(34.57%),包括肉豆蔻酸甲酯、十二酸甲酯及14-甲基-十五烷酸甲酯等,其次是萜烯类物质(18.51%)及吡嗪类(17.63%)。

3 结论

本研究建立了一种有效的分离放线菌的方法,并从茅台大曲中分离筛选出了1株嗜热放线菌(Streptomyces bangladeshensis)FBKL4.004。通过对其酶活和固态发酵产物挥发性成分进行探讨,发现该菌株产糖化酶和果胶酶的能力较为突出,分别为345.03 U/g及318.57 U/g；同时,通过对其固态发酵挥发性成分进行分析,发现酯类物质含量最高(34.57%),其次为萜烯类物质(18.51%)及吡嗪类物质(17.63%)。本研究为发现固态发酵中更多的微生物资源及其在白酒发酵生产中的作用及应用奠定了基础。

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