灰树花液态深层发酵条件研究

李炳功,耿伟涛,赵琰明,王金菊,王艳萍*

(1.天津科技大学 新农村发展研究院,天津 300457；2.河南中沃实业有限公司,河南 济源 459000)

灰树花(Grifolafrondasa),又称贝叶多孔菌,栗子蘑,莲花菇,千佛菌,日本称之为舞蘑,美国称之为林鸡,隶属于担子菌亚门层菌纲多孔菌科树花菌属。其外观为灰白色,其形如卷心菜,婀娜如云,其肉质脆嫩,其味如鸡丝,且芬芳诱人,具有独特香气,被誉为“食用菌王子”［1］。子实体呈莲花形,其分支形似菜花,重叠丛生,菌盖为扇形,菌肉呈软木质,孢子呈卵白色［2］。中国预防医学科学院营养等研究机构分析得出,灰树花干品中蛋白质含量31.5%,包含18种氨基酸,占总蛋白含量的23.53%,其中8种氨基酸必需氨基酸占总氨基酸的38.5%,所以灰树花可以与其他食物进行蛋白质互补［3］；脂肪3.2%；膳食纤维33.7%；碳水化合物21.4%；灰分5.1%；富含锌、铁、钙等多种人体所需元素；维生素含量丰富,其中维生素B11.47 mg/100 mg、维生素B20.72 mg/100 mg、维生素E 109.7 mg/100 mg、维生素C 17.0 mg/100 mg,胡萝卜素4.5 mg/100 mg［4］。此外,灰树花还含有多酚［5］和多糖［6］等活性物质,其中灰树花多糖被实验验证具有抗肿瘤［7］、提高免疫力［8-9］、抗病毒［10］、降低血压［11］等生理活性功能。

长期以来,灰树花都是通过固体栽培生产,但是固体栽培生产存在生长周期长,占地面积大,易受季候影响［12］等问题,大大制约了灰树花的开发利用。而采用液体深层培养灰树花的方法,可以在短时间内生产大量菌丝体和代谢产物,且易于控制培养环境的理化条件,便于工业化生产。因此,国内外的研究人员对液态发酵培养灰树花的条件进行了研究,如季宏更等［13］发现灰树花最佳培养条件为接种量10%,搅拌速度140 r/min,培养温度26℃；LEEB C等［14］发现灰树花最佳培养条件为通气量1.16 L/min,搅拌速度166 r/min。此外,研究人员发现其他条件也可以影响灰树花的生长,如李心怡等［15］研究发现交变磁场可以促进灰树花的生长。本研究以灰树花菌丝体生物量和多糖含量为评价指标,优化灰树花液态深层发酵条件,探讨发酵类型对灰树花生长的影响,并实现扩大培养,以期为灰树花的综合开发应用和工业化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

灰树花(Grifolafrondasa)：本实验室保藏,编号为CGMCC No.14358。

1.1.2 试剂

没食子酸(分析纯)：北京化学试剂公司；牛血清白蛋白(纯度98%)：上海蓝季科技发展有限公司；苯酚、Na2HPO4·12H2O(均为分析纯)：天津市四通化工厂；NaH2PO4·2H2O(分析纯)：天津大学科威公司；葡萄糖(分析纯)：河南永昌飞天淀粉糖有限公司；蛋白胨(分析纯)：安琪酵母股份有限公司；琼脂粉(分析纯)：郑州超凡化工有限公司；磷酸二氢钾、硫酸镁(均为分析纯)：江苏科伦多食品配料有限公司；硫酸(分析纯)：廊坊市金海化工有限公司；盐酸(分析纯)：北京化工厂。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基［16］：马铃薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH值自然。

PDA平板培养基［17］：马铃薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,KH2PO42 g,MgSO4·7H2O 1 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH值自然。

液体种子培养基［6］：马铃薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,KH2PO42 g,MgSO4·7H2O 1 g,蒸馏水1 000 mL,pH值自然。

液体发酵培养基：葡萄糖22g,蛋白胨3g,KH2PO41.2g,MgSO4·7H2O 0.8 g,维生素B11.2 g,蒸馏水1 000 mL,pH值自然。

补料发酵培养基：与液体发酵培养基相同。

以上所有培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌,115℃、20 min。

1.2 仪器与设备

MA300A型磁力搅拌器：日本YAMATO公司；BIOTECH-5BGZ型气升式发酵罐、BIOTECH-10JGZ型气升式发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；JA2003型电子分析天平：上海精科天平厂；722E可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；SM-510型全自动灭菌锅：日本YAMATO公司；5415D型离心机：德国EPPENDORF公司；SPX-250A型恒温培养箱：上海煜南仪器有限公司；BS-2F型振荡培养箱：金坛市梅香仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化［18］

用接种铲挖取保存在PDA斜面上的直径为1 cm的灰树花菌丝体块接种到新的PDA斜面试管中,于25℃恒温培养20～25 d,待菌丝满管,保存于4℃冰箱保存备用。

用直径为1 cm的打孔器将之前活化的菌种接种于PDA平板培养基中央,于25℃恒温培养20～25 d,待菌丝长满平板后接种。

1.3.2 摇瓶种子培养

用直径为1 cm的打孔器,从平板上取10个大小相同的菌丝体块接入装液量为100 mL/500 mL摇瓶种子培养基中,于25℃、150 r/min条件下恒温振荡培养4.5 d。

1.3.3 发酵条件优化

(1)搅拌速度优化：选择7 L搅拌式发酵罐,培养温度25℃,通气量2L/min,分别在搅拌速度为100r/min、120r/min、140 r/min条件下培养14 d,根据菌丝体生物量和发酵液中多糖含量确定最佳的搅拌速度。

(2)培养温度优化：在最优搅拌速度条件下,选择7 L搅拌式发酵罐,通气量2 L/min,分别在培养温度为23℃、25℃、27℃条件下培养14 d,根据菌丝体生物量和发酵液中多糖含量确定最佳的培养温度。

(3)通气量优化：在最优搅拌速度和培养温度条件下,选择7 L搅拌式发酵罐,分别在通气量为2 L/min、3 L/min、5L/min的条件下培养14 d,根据菌丝体生物量和发酵液中多糖含量确定最佳的通气量。

1.3.4 不同发酵罐类型对灰树花的影响

分别采用7 L搅拌式发酵罐和气升式发酵罐连接溶氧电极、pH电极、通气装置及搅拌装置,装液量5 L/7 L,按接种量10%接种于发酵罐中,于上述最佳条件下培养,每天取样50 mL分析,考察不同发酵罐类型对灰树花的影响。

1.3.5 灰树花的扩大培养

选取最优的发酵罐类型,将50 L的发酵罐连接溶氧电极、pH电极、通气装置及搅拌装置,装液量30 L/50 L,将培养到10 d的7 L搅拌式发酵罐中的发酵液作为种子液接种,接种量10%,在搅拌速度100r/min、温度23℃、通气量15L/min条件下培养,每天取样50 mL分析。

1.3.6 菌丝体生长情况测定

菌丝体生物量：将发酵液在4℃条件下10 000 r/min离心20 min,收集上清液和沉淀。将沉淀用无菌水洗涤3次,于真空冷冻干燥机中冻干至恒质量,取出称质量,减去滤纸质量,即为菌丝体生物量［19］。

菌丝球直径：随机取10个菌丝球置于90 mm培养皿中紧密的排成一排,用游标卡尺测量其总直径,算出菌丝球平均直径［20］。

1.3.7 灰树花发酵液中多糖含量及残糖量的测定

取10 mL上述离心得到的上清液置于截留分子质量为8 000 Da的透析袋中流水透析,直至透析液中无单糖检测出为止,然后采用苯酚-硫酸法［21］测定其多糖含量。

取1mL上述离心得到的上清液,采用3,4-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法［22］测定灰树花发酵液中的残糖量。

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化结果

2.1.1 搅拌速度对灰树花液态深层发酵的影响

搅拌是食用菌发酵过程中的一个重要因素,适宜的搅拌速度不仅可以充分混合培养液使菌丝处于理想的培养环境中,也可以增加培养基中的溶氧量。搅拌速度对灰树花液态深层发酵的影响如图1所示。由图1可知,随着搅拌速度的增加,灰树花菌丝体的生物量呈现先增加后降低的趋势,在搅拌速度为120 r/min时,菌丝体生物量达到最大为(3.983±0.371)g/L,而发酵液中多糖含量却呈现不断下降的趋势,在搅拌速度为100 r/min时多糖含量最大为(0.291±0.033)g/L,分析原因可能是由于高搅拌速度时,剪切力较大,菌丝易被打断,影响了菌丝的活性和多糖的积累,所以后续实验将采用120 r/min作为最佳的搅拌速度。

图1 搅拌速度对灰树花液态深层发酵的影响Fig.1 Effect of stirring speed on liquid submerged fermentation of G.frondasa

2.1.2 培养温度对灰树花液态深层发酵的影响

图2 培养温度对灰树花液态深层发酵的影响Fig.2 Effect of culture temperature on liquid submerged fermentation of G.frondasa

温度是影响菌丝生长的最重要条件,食用菌适宜的生长温度在22～30℃之间,不同的菌种的最适生长温度不同。培养温度对灰树花液态深层发酵的影响结果见图2。由图2可知,随着培养温度的升高,灰树花菌丝体生物量和发酵液中多糖的含量逐渐降低,当培养温度为23℃时,灰树花菌丝体生物量和发酵液中多糖含量达到最大,分别为(4.537±0.364)g/L和(0.486±0.022)g/L,所以23 ℃为最佳的培养温度。

2.1.3 通气量对灰树花液态发酵的影响

在需氧型微生物发酵中,微生物对培养基中的溶氧量非常敏感,在发酵过程中通入空气可以供给细胞生长所需的O2,同时也有利于除去代谢过程中产生的废气。通气量对灰树花液态深层发酵的影响结果见图3。由图3可知,随着通气量的增加,灰树花的菌丝体生物量和发酵液中多糖含量也随之增加,当通气量为5 L/min时达到最大,分别为(5.805±0.259)g/L和(0.513±0.026)g/L,但考虑到通气量较高时,发酵液剧烈翻腾,有大量的泡沫产生,影响发酵罐的装液量,同时也会增加染菌的几率,所以选择通气量3 L/min为灰树花液态深层发酵的最佳通气量。

图3 通气量对灰树花液态深层发酵的影响Fig.3 Effect of ventilatory capacity on liquid submerged fermentation of G.frondasa

2.2 两种不同类型发酵罐对灰树花液态深层发酵的影响

目前,搅拌式发酵罐和气升式发酵罐是工业化生产中两种主要的发酵设备,本研究在相同的培养条件(搅拌速度120 r/min、培养温度23℃、通气量3 L/min、接种量10%)下,采用7L的这两种发酵罐分别液态深层发酵灰树花14d,每隔1 d取样检测,搅拌式发酵罐和气升式发酵罐对灰树花液态深层发酵过程中残糖量、溶氧量、pH、生物和多糖含量的影响结果见图4。

由图4可知,采用搅拌式发酵罐发酵时,灰树花的适应期较短为3 d,对数期较长为7 d,而气升式发酵罐发酵时,灰树花的适应期和对数期分别是5d和5d,说明搅拌产生有利于灰树花菌丝的分散,从而提高了发酵液中菌丝的浓度,延长数生长期促进了灰树花菌丝体的生长和胞外胞外多糖的合成。在衰亡期阶段,搅拌式发酵培养的灰树花生物量和发酵液中多糖含量分别为10.742 g/L和3.541 g/L,高于气升式发酵罐中生物量(4.802 g/L)和发酵液中多糖含量(1.048 g/L)。采用搅拌式发酵罐和气升式发酵罐对灰树花液态深层发酵14 d时的菌丝体形态见图5。采用搅拌式发酵罐发酵灰树花14 d时,菌丝球直径为(2.725±0.372 mm),菌丝球密度为(306个/10 mL),而采用气升式发酵罐发酵灰树花14 d时,菌丝球直径为(3.225±0.571 mm),菌丝球密度为130个/10 mL),采用搅拌式发酵罐发酵灰树花菌丝球直径较小,密度大,且更加均匀。此外,采用搅拌式发酵罐发酵灰树花发酵液菇香味更加浓郁。综上得出搅拌式发酵罐比气升式发酵罐更适用于灰树花液态深层发酵。

图4 7 L搅拌式(A)及气升式(B)发酵罐液态深层发酵灰树花的动力学曲线Fig.4 Kinetic curves of liquid submerged fermentation of G.frondasa in stirring(A)and airlift(B)7 L fermenter

图5 7 L搅拌式(A)及气升式(B)发酵罐液态深层发酵灰树花的菌丝体形态Fig.5 Mycelium morphology of liquid submerged fermentation of G.frondasa in stirring(A)and airlift(B)7 L fermenter

2.3 搅拌式发酵罐扩大培养灰树花

在得到7 L搅拌式发酵罐液态深层发酵灰树花的最佳条件后,在50L搅拌式发酵罐中进行扩大培养,结果见图6。

图6 50 L搅拌式发酵罐液态深层发酵灰树花的动力学曲线Fig.6 Dynamic curve of submerged fermentation of G.frondasa in 50 L stirred tank fermenter

在搅拌速度100r/min、培养温度23℃、通气量15 L/min,接种量10%的条件下发酵14 d,由图6可知,灰树花发酵培养13 d时生物量和发酵液中多糖含量达到最大值,分别为13.238g/L和3.178g/L,发酵液的pH值从4.64降为3.58,溶氧量降为27.5%,并且发酵液中的残糖量由22 g/L降为3.357 g/L。表明50 L搅拌式发酵罐扩大培养灰树花取得了成功。

3 结论

通过对搅拌转速、培养温度和通气量的研究得出灰树花在7 L搅拌式发酵罐中的最佳液态深层发酵条件为搅拌速度120 r/min、培养温度23℃和通气量3 L/min；同时,通过对比两种不同类型的发酵罐发现,采用搅拌式发酵罐液态深层发酵灰树花14 d时,生物量和发酵液中多糖含量更高,分别为10.742 g/L和3.541 g/L,菌丝球形态更好且密度较高,发酵液菇香味更加浓郁,所以搅拌式发酵罐更适用于灰树花液态深层发酵；此外,本研究成功的在50 L搅拌式发酵罐中进行了扩大培养,发酵14 d时,灰树花的生物量和发酵液中多糖含量分别达到13.238 g/L和3.178 g/L。本研究结果为灰树花的工业化液态培养提供了一定的理论基础和技术支持。

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