植物乳杆菌生物合成苯乳酸条件优化研究

李明华,孟秀梅,2

(1.江苏食品药品职业技术学院,江苏 淮安 223003；2.江苏食品加工工程技术研究开发中心,江苏 淮安 223003)

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)又被称为β-苯乳酸或3-苯基乳酸,是一种安全、高效的生物防腐剂,能够广泛抑制食品中致病性及腐败性微生物的生长繁殖［1］。与其他生物防腐剂相比,苯乳酸还具有诸多优点,如易溶、易在食品中扩散、对酸和热稳定性高等［2］,可广泛应用于食品加工行业中。

目前,已发现多个种属的微生物可合成苯乳酸,如白地霉［3］、丙酸菌［4］、片球菌［5-6］、芽孢杆菌［7］和乳酸菌等［8］。其中,作为重要的益生菌,乳酸菌应用历史悠久且安全性高,已成为合成苯乳酸的研究热点。近年来,已有多名学者应用干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)［9］、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)［10］和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)［11-12］等乳酸菌菌株发酵合成苯乳酸,产量多在2.0 g/L以下。在微生物发酵过程中,发酵液成分复杂,产物后期提取困难,且高浓度的底物和产物都可抑制菌体生长,最终影响到苯乳酸产量。而静息细胞转化法是在反应体系中,以微生物细胞作为催化剂,将外源底物进行结构修饰的一种转化方法。在静息细胞转化过程中,菌体不再生长繁殖,反应体系副产物少,产物易分离纯化,且反应专一性强、转化效率高、反应时间短,反应条件更易控制［13］。本研究尝试应用植物乳杆菌静息细胞作为催化剂,转化苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)合成苯乳酸,并对其反应条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株及试剂

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)RF-16：分离自泡菜中［14］,于本实验室保存；苯乳酸标准品、苯丙酮酸(分析纯),三氟乙酸(色谱纯)：上海阿拉丁试剂公司；甲醇(色谱纯)：德国默克公司；其他主要化学试剂为市售分析纯。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母膏5.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,NaAc·3H2O 5.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,柠檬酸三铵2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,吐温-80 1 mL,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,pH 6.2～6.4。在以上液体培养基中加入20 g/L琼脂粉即为MRS固体培养基。

1.2 仪器与设备

AL104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DNP-9052恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；ZD-85A恒温振荡器：金坛科析仪器有限公司；TGL-20C高速冷冻离心机：上海新拓公司；LC-20AB液相色谱仪：日本岛津公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)：美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将-20℃冰箱内保存的植物乳杆菌菌种划线接种于MRS固体培养基平板上,30℃培养箱内培养至长出菌落,相同条件下转接一次,然后挑取单菌落接种于MRS液体培养基中,30℃、120 r/min摇床培养20 h备用。

1.3.2 静息细胞制备

将活化的菌种按体积分数1%的比例接种于含200 mL MRS培养基的500 mL三角瓶中,30℃、120 r/min摇床培养16 h,然后于4℃、8 000 r/min条件下离心10 min,菌体用50 mmol/L、pH6.5的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer saline,PBS)洗涤两遍,即制得植物乳杆菌静息细胞。

1.3.3 静息细胞转化方法

在100 mL三角瓶中,将缓冲液、苯丙酮酸和静息细胞按一定比例配制成15 mL反应液,密封后置于恒温振荡器中120r/min条件下进行转化反应,反应一定时间后取样,测定上清液中苯乳酸含量。

1.3.4 单因素试验

在15 mL反应体系中,分别在不同转化温度、转化pH、静息细胞质量浓度、苯丙酮酸质量浓度、葡萄糖质量浓度的条件下,反应一定时间后,取样测定苯乳酸含量,确定不同因素对苯乳酸产量的影响。

1.3.5 正交试验

在单因素试验的基础上,以静息细胞质量浓度、苯丙酮酸质量浓度、葡萄糖浓度和转化时间为考察因素,以苯乳酸产量为考察指标,设计4因素3水平正交试验,因素与水平如表1所示。

表1 苯乳酸转化条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for transformation conditions optimization of phenyllactic acid

1.3.6 苯乳酸含量测定方法

按照参考文献［15］,流动相A、B分别为0.05%的三氟乙酸甲醇溶液和0.05%的三氟乙酸水溶液。样品按如下程序洗脱：0～20 min,流动相A 10%～100%,20～23 min保持100%；24～25 min,流动相A 100%～10%。流动相流速1.0mL/min,检测波长210nm,柱温30℃,样品上样量10μL。

2 结果与分析

2.1 不同因素对苯乳酸产量的影响

2.1.1 不同菌龄对苯乳酸产量的影响

静息细胞生物转化在本质上为酶催化的生化反应,细胞内相应酶的含量和活性直接影响产物的产量。因菌体在不同生长阶段相应酶的表达水平差别较大,因此首先要确定不同菌龄细胞的催化活性。在静息细胞质量浓度100g/L、底物质量浓度4.0 g/L、pH6.5的反应体系中,于120 r/min、35℃的条件下摇床转化6 h,苯乳酸产量如图1所示。

图1 菌龄对苯乳酸产量的影响Fig.1 Effect of bacterial age on phenyllactic acid yield

由图1可知,在菌体培养至15～20 h时,苯乳酸产量达到最高,说明该段菌龄细胞内乳酸脱氢酶活性最大,考虑到菌株RF-16在培养至16 h时达到稳定期［14］,细胞得率最高,因此后续试验均采用菌龄为16h的静息细胞进行催化。

2.1.2 静息细胞浓度对苯乳酸产量的影响

图2 静息细胞质量浓度对苯乳酸产量的影响Fig.2 Effect of cell concentration on phenyllactic acid yield

在酶催化反应中,产物产量除了与酶活性相关外,与酶的浓度也有直接关系。在静息细胞反应体系内,细胞浓度决定了酶的浓度。由图2可知,随着静息细胞质量浓度的提高,苯乳酸产量也随之增加,在静息细胞质量浓度为80 g/L时,苯乳酸产量达到最高,为1.31 g/L。但静息细胞质量浓度＞100 g/L时,可能由于传质限制,影响了酶的催化反应,致使苯乳酸产量呈现下降趋势。因此选择静息细胞质量浓度60 g/L、80 g/L、100 g/L进行正交试验。

2.1.3 苯丙酮酸浓度对苯乳酸产量的影响

在静息细胞质量浓度为80 g/L,pH为6.5,底物质量浓度分别为1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L的反应体系中,35℃转化6 h,苯乳酸的产量如图3所示。

图3 苯丙酮酸质量浓度对苯乳酸产量的影响Fig.3 Effect of PPA concentration on phenyllactic acid yield

由图3可知,随着苯丙酮酸质量浓度的提高,苯乳酸产量随之提高,但苯丙酮酸质量浓度＞2.0 g/L后,苯乳酸产量增加缓慢；苯丙酮酸质量浓度＞4.0 g/L后,苯乳酸产量逐渐降低,可能是底物抑制了转化反应所致。因此选择苯丙酮酸质量浓度2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L进行正交试验。

2.1.4 葡萄糖质量浓度对苯乳酸产量的影响

图4 葡萄糖质量浓度对苯乳酸产量的影响Fig.4 Effect of glucose concentration on phenyllactic acid yield

在植物乳杆菌细胞内,催化苯丙酮酸合成苯乳酸的酶为NADH依赖性乳酸脱氢酶［16］,NADH的供应将直接影响苯乳酸的产量。为提供充足的NADH,除了直接在反应体系中添加或在细胞内构建辅酶再生体系外［17］,还可通过在静息细胞反应体系中添加辅助底物的方式构建与细胞自身代谢过程藕合的辅酶再生系统,其中葡萄糖即为常用的辅助底物之一［18-19］。在静息细胞质量浓度为80 g/L,pH为6.5,苯丙酮酸质量浓度为3.0 g/L的反应体系中分别添加不同浓度的葡萄糖,35℃转化6 h,苯乳酸产量如图4所示。由图4可知,葡萄糖的添加显著提高了苯乳酸的产量,在质量浓度为8.0 g/L时,产物产量达到1.63 g/L,比未添加葡萄糖的反应体系提高了23.48%。但是,质量浓度超过12.0g/L后,可能葡萄糖经过代谢后改变了反应体系的pH,从而导致了苯乳酸产量下降。因此选择葡萄糖质量浓度4.0g/L、8.0g/L、12.0 g/L进行正交试验。

2.1.5 转化pH对苯乳酸产量的影响

在静息细胞质量浓度为80 g/L,苯丙酮酸和葡萄糖质量浓度分别为3.0 g/L和8.0 g/L的反应体系中,改变缓冲液的pH,35℃摇床内转化6 h,考察pH对苯乳酸产量的影响。由图5可以看出,转化pH对细胞催化反应有严重影响,pH≤5.5或≥7.5时,苯乳酸产量较低；而pH为6.0～7.0时,苯乳酸的产量较高,其中pH6.5时产量达到最高,为1.56 g/L,说明乳酸脱氢酶在该pH范围内催化活性较高。

图5 转化pH对苯乳酸产量的影响Fig.5 Effect of conversion pH on phenyllactic acid yield

2.1.6 转化温度对苯乳酸产量的影响

图6 转化温度对苯乳酸产量的影响Fig.6 Effect of conversion temperature on phenyllactic acid yield

在生物催化过程中,温度一方面影响酶的催化活性,另一方面也可影响酶的稳定性。为考察温度对苯乳酸产量的影响,在静息细胞质量浓度为80 g/L,苯丙酮酸和葡萄糖质量浓度分别为3.0 g/L和8.0 g/L,pH为6.5的反应体系中,分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下进行转化,结果如图6所示。由图6可知,随着转化温度的升高,苯乳酸产量也随之提高,在转化温度为35℃时,苯乳酸产量达到最高,为1.61 g/L；继续提高反应温度,苯乳酸产量逐渐降低,可能是因为高温影响了酶的活性或稳定性。

2.1.7 转化时间对苯乳酸产量的影响

在静息细胞质量浓度为80g/L,苯丙酮酸和葡萄糖质量浓度分别为3.0 g/L和8.0 g/L,pH为6.5的反应体系中,35℃条件下转化不同时间,比较苯乳酸产量,结果如图7所示。由图7可知,在转化开始的2 h内,苯乳酸产量快速上升,转化至2 h时,产量为1.31 g/L；随后,苯乳酸产量缓慢上升,转化至4 h时,基本达到稳定,为1.63 g/L,进一步延长转化时间,苯乳酸产量没有明显变化,可能因为产物的反馈抑制作用或反应体系pH的变化影响了转化反应的进行,导致苯乳酸产量未进一步的提高。因此,在该反应体系及反应条件下,反应进行4 h后即可停止反应。因此选择转化时间3 h、4 h、5 h进行正交试验。

图7 转化时间对苯乳酸产量的影响Fig.7 Effect of conversion time on PLA yield

2.2 苯乳酸转化的正交试验优化

在前人进行的苯乳酸生物转化条件优化试验中,优化后的最佳转化pH和温度往往和单因素试验最佳值一致［12,20］,因此在本研究中,仅以静息细胞浓度、苯丙酮酸浓度、葡萄糖浓度和转化时间为试验因子,以苯乳酸产量为考察指标,设计4因素3水平正交试验进行优化。试验结果和方差分析分别见表2和表3。

由正交试验分析结果可得,在4个影响苯乳酸产量的因素中,影响大小的顺序为A＞D＞B＞C,即静息细胞质量浓度＞转化时间＞苯丙酮酸质量浓度＞葡萄糖质量浓度；各因素最佳优化条件为A2B2C1D2,即静息细胞质量浓度为8.0 g/L,苯丙酮酸质量浓度为3.0 g/L,葡萄糖质量浓度为4.0g/L,转化时间为4 h。表3方差分析结果表明,静息细胞质量浓度对苯乳酸产量影响显著(P＜0.05),而其他3因素影响不显著。将以上正交试验优化的转化条件进行3组平行试验验证,结果表明,苯乳酸平均产量为1.68 g/L,优于正交试验中的所有组合,说明此工艺条件合理,试验重现性良好。

表2 苯乳酸转化条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for phenyllactic acid conversion conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 细胞重复利用次数对苯乳酸产量的影响

图8 重复次数对苯乳酸产量的影响Fig.8 Effect of repetition times on phenyllactic acid yield

将反应4 h后的静息细胞4℃、8 000 r/min离心10 min后收集,在同样的反应体系中进行催化反应,考察重复使用后细胞的催化活性,结果如图8所示。结果表明,在静息细胞催化过程中,第1～4批次细胞催化活性相对稳定,苯乳酸产量分别为1.65g/L、1.56g/L、1.32g/L和1.35g/L,但在第5次催化中,苯乳酸产量显著下降,为0.89 g/L,仅为初次反应的53.94%,这可能因为经过多次操作后造成部分酶的失活,或辅酶NADH的再生无法满足细胞催化反应所致。

3 结论

本研究采用植物乳杆菌静息细胞作为催化剂,以苯丙酮酸为底物合成苯乳酸。经过单因素试验和正交优化试验,获得了合成苯乳酸的最佳工艺条件为：转化温度35℃、pH 6.5、静息细胞质量浓度80 g/L、苯丙酮酸质量浓度3.0 g/L、葡萄糖质量浓度4.0 g/L、转化时间4.0 h,在该条件下,苯乳酸产量为1.68 g/L,且细胞经过4次重复利用,苯乳酸产量相对稳定。此外,在本研究中,葡萄糖作为辅助底物,可在一定程度上提高辅酶NADH的再生能力［13］,从而显著提高了苯乳酸的产量。

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