一株冠突散囊菌的鉴定、培养差异性及蛋白质全谱分析

李世瑞,蒋立文*,周金沙,陈则典

(1.湖南农业大学 食品科学技术学院,湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南 长沙 410128；3.湖南省食品安全生产工程技术研究中心,湖南 长沙 410013；4.湖南和品茶业有限公司,湖南 长沙 410127)

湖南安化黑茶属于后发酵茶,茯砖茶属于黑茶中的高档茶类之一。目前黑茶保健作用及冠突散囊菌代谢特征是研究的热点。研究表明［1-3］,安化黑茶品质的形成与加工过程中的微生物作用息息相关,微生物对安化黑茶品质和风味的形成发挥了重要的作用。茯砖茶加工中的“发花”过程是茯砖茶独特品质的关键发酵工艺［4-7］。发酵过程中优势微生物冠突散囊菌又名“金花”菌,“发花”的实质是通过控制一定的温湿度条件,促使优势菌——冠突散囊菌生长繁殖产生的金黄色闭囊壳［8-10］,它在茯砖茶中的含量与茶叶滋味、香气、保健作用等密切相关［11-12］。曾斌等［13-15］对茯砖茶“发花”过程中优势微生物及其生物学特性、代谢产物进行系统研究,“发花”过程中“金花”菌的数量是作为黑茶品质好坏的判断标准之一。尽管目前关于茯砖茶中冠突散囊菌的分析筛选文献较多,但对某一个分离菌株进行系统研究的较少。

本研究在周扬艳等［16］对获砖茶中优势微生物在不同培养基的差异性比较的基础上对分离所得到的微生物进行鉴定,同时比较3种培养基对黑茶优势微生物培养菌落形态差异,并利用蛋白质质谱对冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)进行初步分析,研究菌种蛋白质本身的相关指标,期待深入解析其作用,为更好研究纯种“金花”特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

2008年金花茯砖：益阳安化茶厂。

1.1.2 试剂

生理盐水(0.8%)：实验室自行配制；2×Mix,内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)引物：由鼎国公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基［18］

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基(编号为A)：马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH自然。

CZG培养基(编号为B)：蔗糖40g,NH4NO30.3g,K2HPO40.1g,MgSO4·7H2O0.05g,NaCl14g,琼脂3g,蒸馏水100mL,pH自然。

40%蔗糖麦芽浸膏琼脂(M40Y Agar,M40Y)培养基(编号为C)：蔗糖400.0 g,麦芽提取物20.0 g,酵母提取物5.0 g,琼脂粉20.0 g,蒸馏水1 000 mL,pH自然。

氯硝胺18%甘油琼脂(dichloran glycerol agar,DG18)培养基(编号为D)：葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,KH2PO41.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,二氯硝基苯胺2.0 mg,1.0%氯霉素溶液10.0 mL,蒸馏水1 000 mL,pH自然。

1.2 仪器与设备

TP-620A电子天平：湘仪天平设备有限公司；101-2AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SW-CJ系列超净工作台：上海新苗医疗器械制造有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：海申安医疗器械厂；MJ-250B5-II霉菌培养箱：上海玺恒实业有限公司；DL9700基因扩增聚合酶链反应(polymerase chain reaction PCR)仪：东林昌盛有限公司；TMC恒温孵育器：鼎国昌盛有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌落及细胞形态特征观察

制备茶叶菌悬液,采用混合平板接种培养,采用PDA培养基进行培养。分别吸取10-4、10-5菌悬液1 mL至无菌平皿中,并对应倒入已冷却至45～50℃的PDA培养基(每种培养基中每个稀释梯度做3个重复),冷凝后倒置于28℃恒温生化培养箱中进行黑暗培养。获得生长速度快、菌丝致密、孢子量多的单个菌落,继续进行多次点种培养,获得纯菌落后转接入斜面培养28℃/72 h。同时以无菌操作PDA点种后观察菌落形态,利用光学显微试验观察子囊果的情况。

1.3.2 分子生物学鉴定步骤

(1)菌株基因组的提取：参照文献［17］进行。

(2)目的片段扩增和产物回收：合成引物的序列：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；反应体系：2×Mix 25μL；ITS1(10μmol/L)1μL；ITS4(10μmol/L)1μL；DNA模板2μL；添加dd H2O至50μL。扩增反应条件：预变性94℃/5 min；变性94℃/30 s；退火54℃/30 s；延伸72℃/50 s,变性、退火、延伸三个步骤进行35次循环；延伸72℃/10 min。

用2%琼脂糖凝胶电泳检测,利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

(3)测序及其结果BLAST比对：将PCR产物送至鼎国公司进行纯化和测序,将测序得到的序列提交到Genbank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/),通过BLAST同源性比对分析,找到同源性高的菌种并构建进化树。

(4)利用DNAstar构建系统发育树：以5.8SrDNA的ITS序列同源性＞99%为标准进行属种归类。然后再对测试菌株利用DNAstar软件构建系统发育树,进一步进行种属鉴定。

1.3.3 冠突散囊菌在A、B、C、D特异性培养基上生长培养

将分离得到的纯菌株制成一定浓度的孢子悬浮液,采用混合培养法,分别记录该菌株在A、B、C、D培养基上28℃恒温培养培养9 d、18 d后的表征进行描述,如菌落密集程度、菌体颜色、培养基的正反面着色情况等,进行差异性描述。

1.3.4 蛋白质全谱的测定

(1)蛋白提取：将分离纯化的纯种斜面收集培养物,用200μL0.06mol/L的溴化四乙胺(tetraethylammoniumbromide TEAB),用超声破碎仪进行破碎,加入4倍体积的冷丙酮(-20℃预冷,含终浓度为10mol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT))沉淀2 h,13 000 r/min离心20 min,收集沉淀；加入800μL的冷丙酮(含终浓度为10 mol/L DTT)重悬沉淀；13 000 r/min离心20 min,收集沉淀,然后液氮吹干沉淀,加入100μL的TEAB溶解蛋白；(2)蛋白质定量：采用Bradford法定量；(3)蛋白质的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)(10%SDS 30%AGE)检测、酶切、标记；(4)除盐：将标记过程中的标记试剂和相关缓冲液中的盐除去,以便于后续分析；(5)等量混合各样本中的标记肽段；(6)MS/MS质谱检测及分析；(7)生物信息分析。上述结果测定在杭州联川生物信息技术有限公司完成。

1.3.5 微生物蛋白质全谱的分析

Uniprot/Mucor(包含23827条蛋白质序列)(更新于2016年3月)数据库。采用与AB Sciex 5600 plus配套的搜索引擎——ProteinPilot v4.5进行数据解析。微生物蛋白质全谱分析的数据库选择遵循如下原则：若为已经测序的生物,直接选用该物种数据库,若为非测序生物,则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。

2 结果与分析

2.1 菌落的形态特征

采用混合培养法得到的纯种在PDA平皿上生长菌落为较规则的圆形,呈亮丽的金黄色,菌落中间的颜色较四周深且略偏褐色,菌落的外周围明显可见白色菌丝(见图1A)。利用光学显微镜可以明显看到能清楚看到子囊果(见图1B)及释放子囊果(见图1C)。

图1 分离微生物的菌落形态及子囊果特征Fig.1 Colony morphology and ascocarp characteristics of the isolated microorganisms

2.2 分子生物学鉴定

将纯化菌株送至北京鼎国昌盛生物有限公司检测,得到PCR扩增电泳图(见图2),可知扩增后的分子质量约为500 bp。把菌株的ITS序列片段通过BLAST程序在GenBank上进行相似性检索,构建系统发育树,结果见图3。结果表明,菌株strain2-seq与数据库中的冠突散囊菌具有99%的相似性,说明此菌株为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。

图2 菌株的ITS区域PCR扩增结果Fig.2 Results of PCR amplification of strain ITS region

图3 基于5.8S rDNA序列鉴定菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA sequence analysis

2.3 冠突散囊菌在不同培养基的菌落表征比较

采用混合培养法将分离菌株strain2-seq接种到不同培养基28℃恒温培养,并比较9 d、18 d时培养基两面的菌落生长情况,结果见表1。

由表1可知,在培养基A上培养9d菌落内部褐色周边淡黄色；培养18 d菌落大部分呈较深的黑褐色,菌落外周围有明显的棕黄色晕圈,较干燥,具明显自溶现象,正反面特征相近。在培养基B上培养9 d具亮丽的金黄色,菌落中部呈土黄色稍突起,形状较规则、丝绒状、菌落较厚；培养18 d菌落近于橙黄色,周围呈红色,其他为黄色,反面呈血红色,周围为棕黄色。在培养基C上培养9 d菌落中心为橄榄褐与橄榄绿相间,外周围为偏暗的橙黄色,菌落周围为黄褐色,空白处为金黄色,菌落背面中间为深褐色,外四周为暗红色,培养基为金黄色；培养18 d菌落呈较深的橙红色,菌落为橄榄绿、橄榄褐、橙黄色相间,菌落背面为棕褐色,且菌落周围培养基较空白处色彩加深,菌落较周围突起、致密。在培养基D上培养9 d菌落最外层为亮丽的金黄色,个别菌落为橙黄色,同时可观察到部分菌落上的渗出液有消去的迹象,使菌落较之前为平坦,呈青灰色,边缘为棕黄色,菌落背面呈黑褐色,边缘为较深的暗红色,培养基的正反面为红褐色,部分空白处为金黄色,菌落密集,菌落中心有黑色渗出液,呈油状、浓而黏稠、具有光泽；培养18 d后,渗出液愈加浓稠,部分已基本消失,使得菌落干燥,中心凹陷,较不平整,呈较深的棕黄色,菌落背面为棕黑色,培养基的正反面呈较深的暗红色。

表1 从茯砖茶中获得主要微生物不同培养基培养的形态表征图Table 1 Morphological characterization of the main microorganisms from Fuzhuan brick tea separated by different media

综上比较分析,冠突散囊菌在四种培养基上的生长速度差异较大,形成的孢子颜色和分泌色素差异较大,同时发现该菌培养时间达到18 d,且在培养过程中完全依赖了培养基本身水分,这说明在不同培养基中该菌显示不同的生长特性,同时能够在14%盐度和40%蔗糖含量条件下生长,体现了较强的耐干性和耐渗透性,这也为茯砖茶在长期存放过程金花菌可以继续生长提供了科学依据,但表征差异性是否会影响到代谢性能变化有待探索。

2.4 菌株的蛋白质及质谱分析鉴定结果统计

采用基于质谱方法的蛋白质组鉴定基本流程,即对MS/MS质谱数据经过系列优化处理后与数据库进行相似性比较打分从而进行蛋白鉴定。质谱产生的二级谱图数、解析的二级谱图数以及鉴定到的肽段数和蛋白数总体情况见表2。

表2 冠突散囊菌蛋白质鉴定结果Table 2 Identification results of protein from E.cristatum

2.4.1 Unique肽段数分布

Unique肽段指每个蛋白或者蛋白家族特有的多肽序列,即仅在一个蛋白质中存在的肽段。由这类型肽段的存在,可以唯一地确定相应蛋白质的存在。样品中鉴定到的包含所有蛋白的95%可信度Unique肽段数的双坐标分布结果见图4。

图4 冠突散囊菌中鉴定蛋白中的Unique肽段数分布Fig.4 Unique peptide distribution of identified proteins in E.cristatum

由图4可知,供试样品鉴定结果中,至少含有Unique-2肽段的蛋白质占总蛋白质的73.34%,数目为1373个。Unique肽段是蛋白质所特有的、能够将其与其他蛋白质特异性区分的肽段序列,即该菌独有的肽段,在至少含有Unique-2肽段在鉴定比例达到70%以上,说明其独特性,这为进一步研究的不同冠突散囊菌本身蛋白特性及不同来源的冠突散囊菌发酵差异性分析提供了依据。

2.4.2 肽段长度分布

在样品蛋白质足量的情况下,利用质谱仪鉴定到肽段的长度分布结果见图5。由图5可知,样品鉴定到肽段的长度为12个的肽段最多,肽段长度区域在8～22个之间,平均肽段长度为15.05个。若鉴定到的肽段偏高或者偏低,则说明实验阶段选择使用的酶不恰当,使得酶切肽段大部分高于或者低于质谱仪的检测范围,从而使得可检测肽段偏少,鉴定蛋白数目降低。本次鉴定在肽段长度11、12鉴定到肽段主峰,介于全部的的鉴定范围中值,保证鉴定到足够多的蛋白。

图5 冠突散囊菌菌体蛋白质种肽段长度分布Fig.5 Peptide segment length distribution of E.cristatum

2.4.3 蛋白覆盖度分布

样品中蛋白质鉴定(95%可信度肽段)覆盖度分布饼图见图6。由图6可知,供试样品鉴定覆盖度≥20%的蛋白质百分比为30.93%,覆盖度在［0～10%］范围内的蛋白占总蛋白的43.27%,平均蛋白质的鉴定覆盖度为16.33%。蛋白鉴定主要是鉴定Unique肽段(Unique肽段指每个蛋白或者蛋白家族特有的多肽序列),而Unique肽段占蛋白质全长的比例较低,说明该菌株个体的差异性,间接说明此数据具有一定的可信度。

图6 冠突散囊菌蛋白鉴定覆盖度的整体分布Fig.6 Overall distribution of identification coverage of protein in E.cristatum

3 结论

根据菌落形态特征分析、显微镜镜检分析及分子生物学鉴定,结果表明所获得的菌株为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。从“金花”菌的表征形态差异来看,其呈现的差异性体现在其耐高渗、高盐的生长特性,但在实验室或实际生产中到底培养多长时间合适或保存不同时间对发酵性能有何影响等诸多方面,在以后的研究中还需进一步研究和关注。

从菌体蛋白质质谱分析来看,由于没有相关数据比较,无法直接说明比较其作用相关特性。以上这些分析数据只针对这一分离得到的纯种冠突散囊菌得到的数据,若需要详细分析有待寻找标准菌株来进行对照,还需要对更多的样本进行比较,以确定最终的标准菌株。从目前中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国工业微生物菌种保藏管理中心登记的冠突散囊菌仅14种,其具体差异性不清楚。在以后研究中将宏基因组学、蛋白组学、代谢组学等相结合,研究该菌在黑茶发酵过程中酶系形成与物质转化、功能关系联系起来,该菌中广泛存在的次级代谢产物资源还可能被继续挖掘和利用,为发酵黑茶功能多样性分析奠定基础。

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