卡那霉素单克隆抗体制备以及化学发光免疫检测试剂盒的研制

万宇平,彭庆军,于海浪,郑迎春,贾芳芳,冯月君

(1.北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206；2.北京市门头沟区动物疫病预防控制中心,北京 102308；3.江苏益客食品集团有限公司,江苏 南京 210000；4.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心,北京 102206)

卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,经常用于治疗由革兰氏菌引起的感染,由于卡那霉素杀菌具有高效性和广谱性,因此在畜牧养殖业中应用广泛,常常导致动物源性食品中抗生素的过度残留,通过富集作用进入人体,可能会引起一定程度的耳毒性［1-5］。

化学发光免疫分析法是利用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。一般情况下,化学发光免疫分析仪包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。前者是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子,利用发光信号测量仪器测量光量子产额。后者是将发光物质直接标记在抗原或抗体上,或酶作用于发光底物。

目前,测定卡那霉素有微生物法、高效液相色谱、传感器法、酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbentassay,ELISA)等［6-12］。化学发光检测方法［13-15］的自动化程度较高,操作简便,优于以上三种方法,其配套仪器化学发光仪能够同时检测多种样本,检测速度可达到150样本/h,对单一样本可同时检测15个项目,检测灵敏度达到0.01μg/L,能够充分发挥国产试剂和仪器的成本优势,更加适宜于基层实验室的大批量样本检测,不必在物力和人力二者之间进行两难选择,对于食品安全检测环节具有实际意义。本研究应用化学发光检测原理,制备出检测牛奶和奶粉中卡那霉素的化学发光检测试剂盒,以期为基层实验室提供优质选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卡那霉素标准品(CAS：59-01-8)：北京标准物质研究中心；邻苯二甲酸酐、吡啶、乙醇、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、鲁米诺：北京百欣试剂公司；牛奶和奶粉：市售；发光底物液、复溶工作液、小鼠脾细胞：北京勤邦生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

HMC-D2全自动化学发光免疫分析仪：北京勤邦生物技术有限公司；MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制备抗原

(1)半抗原的制备

将1.0 g卡那霉素、0.3 g邻苯二甲酸酐和2 mL吡啶加入至10 mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)中,形成混合液,室温下,搅拌反应12 h,通过减压蒸除溶剂,在乙醇中重结晶,得到邻苯二甲酸单卡那霉素酰胺(卡那霉素有4个活性氨基,但是最活泼的是与邻苯二甲酸酐连接的氨基,通过降低温度(室温反应),降低邻苯二甲酸酐用量,来控制上那最活泼的氨基上),卡那霉素半抗原的合成路线见图1。得到半抗原产物质量0.69 g,得率53%,其计算公式如下：

图1 卡那霉素半抗原合成路线Fig.1 Synthesis route of kanamycin hapten

(2)免疫原的制备

取20mg邻苯二甲酸单卡那霉素酰胺,溶解于1mLDMF中,取30 mg碳二亚胺(carbodiimide,EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS),用0.2 mL水充分溶解后加至邻苯二甲酸单卡那霉素酰胺溶解液中,室温下搅拌24h,即可得到反应液A。称取50mg牛血清白蛋白(BSA),使之充分溶解在3.8 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.2)中,将反应液A逐滴缓慢滴加到该蛋白溶液中,并于室温条件下搅拌24h,用0.01mol/LPBS 4℃透析3 d,每天换3次透析液,目的是除去未反应的小分子物质。得到的免疫原保存于-20℃。

(3)包被原的制备

参照免疫原的制备方法,除所用蛋白为卵清蛋白外,其他操作均相同。

1.3.2 制备单克隆抗体、酶标记抗原

将1.3.1得到的卡那霉素免疫原依次进行动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、单克隆抗体制备等操作［16］,最终得到卡那霉素单克隆抗体。

称取2 mg辣根过氧化物酶［17］溶解于0.5 mL双蒸水中；加入0.5 mL新配制的0.06 mol/L NaIO4溶液,4℃避光作用30 min；加入160 mmol/L的乙二醇0.5 mL,室温作用30 min；加入卡那霉素-OVA 2 mg,混匀后装入处理过的透析袋中,置1 000 mL的0.05 mmol/L碳酸钠缓冲液中透析,4℃过夜；透析液吸至10 mL的离心管中,加0.25 mL新配的5 g/L NaBH4液,混匀后置4℃2 h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液,4℃作用30min,在4℃条件下3000 r/min离心25min,弃上清；将沉淀溶于1.5 mL 0.02 mol/L pH 7.4 PBS中,吸入透析袋内,在0.02 mol/L pH 7.4 PBS透析,4℃过夜(中途更换PBS3次)；将透析液中液体吸至微量离心管中,4℃条件下10000r/min离心30min,将上清液吸出,加等量甘油,混匀,-20℃保存备用。

1.3.3 试剂盒检测方法

全自动化学发光免疫分析仪通过测定卡那霉素标准品(质量浓度依次为0、0.05μg/L、1.05μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、2.70μg/L)发光值,绘制标准曲线。从全自动化学发光免疫分析仪主菜单进入测试要求屏幕；在试剂区设置试剂盒的位置；标准品区、样品区分别设置标准品和样品位置；按下运行键开始检测；系统会自动计算检测结果。

1.3.4 牛奶和奶粉样本的前处理方法

取50μL鲜牛奶样本于8 mL玻璃试管中加950μL复溶工作液,涡动混匀。

称取(0.50+0.05)g奶粉样本,加入2.5 mL复溶工作液,涡动混匀；取300μL于8 mL玻璃试管中加入900μL复溶工作液,涡动混匀。

1.3.5 检测性能

(1)计算检测限

分别检测20份牛奶和奶粉空白样本,利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差,计算检测限(limitof detection,LOD),即最低被测物浓度［16］。

(2)精密度和准确度

我国国家标准《动物源食品中兽药残留限量》中规定了鸡肉中卡那霉素的最大残留限量为100μg/kg［17］。目前暂无化学发光试剂盒相关文件,因此参考《农残办技术材料要求及审查程序》规定,即当试剂盒检测有最高残留限量(maximum residuelimit,MRL)的药物时,测定回收率的添加浓度分别为0.5×MRL、1×MRL和2×MRL(或1.5×MRL)。因此,本研究按照上述要求,分别对牛奶样本添加卡那霉素,使其质量浓度达到50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg,测定加标回收率,以此评价该试剂盒的准确度。同时,每个样本做4个平行,计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),以此评价该试剂盒的精密度。

(3)测定稳定性

将试剂盒放置于4℃保存,每月测定一次牛奶样本的回收率和半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50),连续测定12个月。

(4)测定抗体特异性

链霉素、双氢链霉素、新霉素与卡那霉素的结构类似［18］,测定这三种药物的IC50,根据下式计算该试剂盒对于链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率：

2 结果与分析

2.1 鉴定半抗原

利用核磁共振氢谱法测定1.3.1制备的半抗原,如图2所示,8.0 mg/kg左右的芳香烃信号和11.0 mg/kg羧基峰信号的出现说明半抗原合成成功［19-20］。

图2 卡那霉素半抗原核磁共振氢谱Fig.2 HNMR of the kanamycin hapten

2.2 标准曲线

全自动化学发光免疫分析仪通过测定卡那霉素标准品(质量浓度依次为0、0.05μg/L、1.05μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、2.70μg/L)发光值绘制标准曲线,结果见图3。

图3 卡那霉素标准曲线Fig.3 Standard curve of kanamycin

由图3可知,标准曲线方程为y=-3.082 4x-1.341 0,R2=0.996 7,线性范围为0～2.70μg/L,检测灵敏度为0.05μg/kg,IC50(半抑制浓度)值为0.305μg/L。

2.3 计算检测限

20个牛奶空白样本中卡那霉素的检测结果见表1。检测限以测定平均值加3倍标准差计算。

表1 牛奶空白样本检测限测定结果Table 1 Detection limit results of milk blank samples

表2 奶粉空白样本检测限测定结果Table 2 Detection limit results of milk powder blank samples

由表1、表2可知,20个牛奶样本中卡那霉素的测定结果平均值为0.35μg/kg,RSD为0.18%,检测限为0.89μg/kg；20个奶粉样本中卡那霉素的测定结果平均值为0.34μg/kg,RSD为0.20%,最低检测限为0.95μg/kg。

2.4 精密度和准确度

测定添加不同质量浓度卡那霉素的牛奶样品的精密度及准确度试验结果见表3。

表3 牛奶样品精密度及准确度试验结果Table 3 Precision and accuracy tests results of milk samples

由表3可知,回收率范围是80.6%～105.6%,当添加质量浓度分别为50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg时,批内相对标准偏差范围是3.0%～9.2%；批间相对标准偏差范围是6.5%～7.7%。可见,批内、批间相对标准偏差均＜10%,试剂盒精密度及准确度良好。

2.5 测定稳定性

将试剂盒保存在4℃,每月测定IC50值和回收率,稳定性结果见表4。由表4可知,测定无添加卡那霉素试剂盒的半数抑制浓度范围是0.25～0.37μg/L,卡那霉素添加回收率范围是80.5%～103.8%,由此可见,各指标均在正常范围之内。该试剂盒在4℃至少能够保存12个月。

表4 试剂盒在4℃保存的稳定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

2.6 抗体特异性的测定

卡那霉素抗体与链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率见表5。

表5 交叉反应率试验结果Table 5 Results of cross reaction rate tests

由表5可知,卡那霉素抗体与链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率分别为7.1%、9.0%、4.6%,交叉反应率低,由此可见,卡那霉素抗体特异性良好。

2.7 讨论

在快速检测方法的文献中,利用酶联免疫方法检测卡那霉素居多,说明ELISA方法在该领域应用比较成熟,而化学发光检测方法尚未广泛应用于快速检测行业,本研究具有一定的参考价值。裴道国等［21］研究的ELISA试剂盒对动物源性食品中卡那霉素的检测限为10μg/kg,本研究检测限为0.89μg/kg。

3 结论

本研究制备了抗卡那霉素单克隆抗体,并研发出相应的化学发光试剂盒,试剂盒的标准曲线范围0～2.70μg/L,对奶粉的检测限为0.95μg/kg,对牛奶的检测限为0.89μg/kg,对牛奶的回收率为80.6%～105.6%,批内RSD范围是3.0%～9.2%,批间RSD范围是6.5%～7.7%。特异性方面良好,卡那霉素单克隆抗体与链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率分别为7.1%、9.0%、4.6%。化学发光试剂盒能够在4℃条件下保存12个月,IC50值和回收率指标均在正常范围内,稳定性较好［22］。

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