糠醛渣的预处理、酶解优化及同步糖化发酵

李乔丹,刘 彬,庄倩倩,刘同军*

(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院,山东 济南 250353)

糠醛是一种重要的化工原料,其衍生的化工产品高达上千种,广泛应用于医药、农药、纺织和石油等行业［1］。近年来,我国的糠醛生产工艺发展迅速,已然成为糠醛的生产和出口大国。工业上一般用玉米秸秆,玉米芯等原料生产糠醛［2-3］。每年在我国能产生几千万吨的糠醛渣废料,怎样合理利用糠醛渣是现如今所需要面临的难题,这对于环境保护,开发新能源上有重大意义［4-5］。近些年来,人们对糠醛渣也做了大量的研究。在20世纪90年代,杨柳青等［6］将糠醛渣作为土壤改良剂,将一些盐碱地成功改良,结果显示糠醛渣有明显的改土增产,增肥地力的作用。岳中辉等［7-8］对糠醛渣的研究发现,将糠醛渣作为棉籽壳、稻壳的替代产品应用于作物培育,在解决污染问题的同时缓解了供需矛盾,降低生产成本,实现双赢。汪南方等［9］报道,可以利用糠醛渣进行微波辐照来制备活性炭,这样降低了活性炭的生产成本,具有一定的经济效益和社会效益。孙冉等［10］研究了糠醛渣在发酵罐中同步糖化发酵生产纤维乙醇的过程,为糠醛渣转化纤维乙醇实现工业化提供了一些理论依据。

随着化石燃料的不断开采,石油在国际上已经供不应求,价格也越来越高,并且伴随着化石燃料的过度使用,出现越来越严重的环境问题,如温室效应、酸雨等。为了解决化石燃料的过度使用所带来的环境和能源危机等问题,人们一直在寻求一种可持续的清洁能源,那就是生物质能源,包括生物乙醇和生物柴油。其中生物乙醇是目前最重要的一种生物燃料,它已经占了生物燃料的使用量90%以上,近年来掀起了一股怎样实现规模化生产纤维素乙醇的浪潮［11-13］。由于糠醛渣含有丰富的纤维素,它是工业上生产纤维乙醇的潜在原料［14-15］。但大部分企业受技术条件的限制,无法解决生产成本的问题,所以都没有实现糠醛渣的规模工业化再利用。

目前,这一研究也受到了广泛的重视,糠醛渣含有较高的木质素,通过碱性过氧化氢(alkalinehydrogen peroxide,AHP)预处理后能有效地脱除木质素,能有效的提高糠醛渣的酶解转化率。本研究的目的就是通过AHP预处理糠醛渣来提高它酶解的转化率,从而提高糠醛渣的糖收益。同时,还研究了水洗过程对糠醛渣酶解的影响。通过正交试验对糠醛渣同步糖化发酵(simultaneous saccharification fermentation,SSF)进行优化,以期为糠醛渣生物乙醇工业化生产探索出合理有效的途径。

1 材料与试剂

1.1 材料与方法

1.1.1 原料

糠醛渣由山东省德州市宁津开源化工有限公司提供,自然风干后,水分含量为7.12%,经粉碎机粉碎后过40目筛,密封保存。

1.1.2 试剂

纤维素酶(310 FPU/mL)、半纤维素酶(600 FPU/mL)、果胶酶(500 U/g)：丹麦诺维信(中国)有限公司；酿酒活性干酵母(耐高糖型)：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司、硫酸溶液：莱阳经济技术开发区精细化工厂；NaOH溶液：天津博迪化工股份有限公司；H2O2：莱阳经济技术开发区精细化工厂。所有化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PB-10型pH计：德国赛多利斯公司；MQD-B3NR型恒温振荡培养箱：上海旻泉仪器公司；LC-20A型高效液相色谱仪：日本岛津公司；iCen24型高速离心机：杭州奥盛仪器有限公司；DHG-9075A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；CR-MJ-12型马弗炉：洛阳昌瑞炉业有限责任公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；9FZ～23型齿爪式粉碎机：四川渐飞机械制造有限公司；UV-5500PC紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 AHP预处理

按照NaOH 0.1 g/g糠醛渣,H2O20.025 g/g糠醛渣加量,称取10 g糠醛渣于250 mL锥形瓶中,称取1 g NaOH溶于99.24 mL水中,搅拌均匀,倒入锥形瓶中,与底物充分搅拌,然后用移液器吸取758μL H2O2加入到锥形瓶中,用5 mol/L NaOH调节pH至11.7,将锥形瓶放置在恒温振荡器中振摇,转速为160 r/min,振摇24 h,即可得到糠醛渣的预处理液。

1.3.2 糠醛渣的水洗

将AHP预处理过后的糠醛渣用16层纱布进行过滤,用自来水缓慢冲洗,每次100 mL,并用玻璃棒不断搅拌,重复3～5次,直至过滤出的水呈中性即可完毕。

1.3.3 糠醛渣同步糖化发酵

通过单因素试验,确定了反应的最适温度为30℃,最适pH为4.9,最适酶用量为20 mg酶蛋白/g葡聚糖,最适发酵时间为72 h。在单因素试验基础上,采用正交试验对SSF乙醇工艺进行优化,通过考察反应温度、pH、酶用量、发酵时间等4个因素,选用L9(34)正交表进行优化设计。用体积分数为72%的H2SO4将AHP预处理24 h的糠醛渣调节pH,高温蒸汽灭菌(121℃、20 min)；冷却后加入规定量的纤维素酶,酵母活化后按发酵体积的10%接种,用保鲜膜封口,并且在橡皮塞上插上一枚注射用钢针以释放发酵过程中产生的二氧化碳,放置在摇床上,按照规定的反应温度进行摇瓶厌氧发酵,转速为160r/min。定时取样,每24h取1次,每次400μL发酵液,离心分离,取100μL上清液,稀释10倍,用于检测葡萄糖和乙醇浓度。

酵母的活化：称取0.64g干酵母加入到200mL 2%的葡萄糖水溶液中,放置在30℃摇床中振摇2 h,转速为160 r/min,得到酵母活化液。

SSF培养基配料比：蛋白胨0.5 g,100 mL糠醛渣预处理液(含糠醛渣原料20 g)。

1.3.4 分析方法

糠醛渣主要成分分析：纤维素,木质素及其他主要成分测定参照美国国家可再生能源实验室(national renewable energy laboratory,NREL)标准方法进行测定［16］。

葡萄糖及酒精浓度使用高效液相色谱法进行测定,其色谱条件为：Aminex-HPX87H色谱柱(100 mm×7.8 mm),示差-折光检测器,流动相0.005 mol/L H2SO4,柱温65℃,流速0.6 mL/min,示差检测器温度为30℃,进样量20μL,通过建立标准曲线对葡萄糖和乙醇浓度进行计算。葡萄糖转化率和乙醇理论转化率的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 糠醛渣成分分析

采用NREL法进行成分分析的结果如图1所示。由图1可知,糠醛渣的纤维素含量为47.35%,木质素含量为39.81%,与未处理的生物质原料如玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆等作物秸秆相比,糠醛渣纤维素含量相对较高,半纤维素含量非常低,理论上来讲,如果能转化成葡萄糖就可以转化成液体燃料或其他高附加值化学品［17-18］。

图1 糠醛渣成分分析Fig.1 Components analysis of furfural residue

2.2 预处理对酶解的影响

按照1.3.1的实验方法,分别对5%、10%、15%、20%、25%这5种底物浓度的糠醛渣进行AHP预处理。预处理过后,向每一种底物的糠醛渣中加入纤维素酶,加酶量为30 mg酶蛋白/g葡聚糖,加完酶后将每种底物浓度的糠醛渣放置在50℃的摇床中,振摇24 h后,酶解过程结束,酶解结果如图2所示。由图2可知,通过AHP预处理过的糠醛渣酶解转化率明显高于未预处理的糠醛渣,其中10%底物浓度24 h酶解转化率最高,为96.46%,未预处理的糠醛渣的酶解率为70.19%,相比于未预处理的酶解转化率提高了37.44%。15%底物浓度的预处理的糠醛渣酶解转化率为89%,而未预处理的只有76.91%。20%底物浓度的糠醛渣中,预处理的酶解率为88.91%高于未预处理的81.63%。玉米芯、玉米秸秆等农作物秸秆的木质素含量大约在30%～35%,而本研究的糠醛渣木质素含量为39.58%,所以糠醛渣的木质素含量相对于其他的农作物秸秆来说较高。木质素是纤维素和半纤维素转化成单糖的主要障碍,据文献［19-20］报道,H2O2能够脱除木质素,并且保留了绝大部分的纤维素。因为在碱性条件下,H2O2会分解生成HOO-,使木质素侧链的双键结构断裂,从而降低木质素的分子质量,使之溶出。同时,木质素是碱溶性的,通过这双重作用能够明显提高糠醛渣的酶解转化率。

图2 不同底物浓度对糠醛渣葡萄糖转化率的影响Fig.2 Effect of different furfural residue substrate concentration on transformation rate of glucose

通过比较5%,10%,15%三种底物浓度的酶解转化率随时间的变化趋势可知(见图3),糠醛渣在0～24 h的酶解转化率迅速升高,在24 h后,酶解转化率升高非常缓慢,最后逐渐趋于平衡。在24 h时3种底物浓度的糠醛渣的酶解转化率就分别达到了97.86%、96.46%、94.29%。王东等［21］利用碱预处理过的稻草秸秆酶解转化成葡萄糖研究认为酶解24 h后转化率的提高不大,主要是因为随着酶解时间的增加,酶活力下降,降解纤维素的能力下降,从而导致24h后纤维素转化率提高不大。而本研究认为5%,10%底物浓度的酶活下降可能是由于酶活力下降导致的,而在15%浓度时,水解效率降低的原因是多方面的,主要因素可能是底物浓度较高,体系里的水比较少,随着反应的进行,体系的传质问题会逐渐影响葡萄糖的水解。而且降解出来的纤维素类基质会释放拮抗因子、降解产物葡萄糖的积累也会产生阻遏效应,这些都能够影响酶解的转化率。由于24 h之后酶解转化率提升较低,所以确定糠醛渣酶解的最优时间为24 h。

图3 不同底物浓度对AHP预处理的糠醛渣葡萄糖转化率的影响Fig.3 Effect of different substrate concentration on transformation rate of glucose of AHP pretreated furfural residue

2.3 加酶量的优化

以酶解转化率为考察指标,利用Design-Expert8.0软件进行Mixture设计,其试验方案与结果如表1所示。

表1 Mixture设计试验结果Table 1 Results of Mixture experiments design

2.3.1 回归模型的建立

通过Mixture设计与分析,以酶解转化率为考察指标,使用Design-Expert8.0软件对表1中数据进行二次回归拟合后,得到酶解最优加酶组合的回归模型为：

Y=78.01A+45.36B+8.05C+10.75AB+71.95AC+26.62BC

2.3.2 回归方程的显著性检验与方差分析

Mixture设计分析对试验结果进行拟合的二次模型方差分析见表2。由表2可知,总回归方程F检验P＜0.000 1,达到极显著水平,说明该模型与实际结果拟合非常好,该回归模型的决定系数R2为0.964 1,即该模型可以解释酶解转化率96.41%的变化。

表2 回归模型显著性检验Table 2 Significance test of regression model

回归方程各项的方差分析结果还表明,AB、AC及BC的交互作用对酶解转化率的影响均达到极显著水平(P＜0.01)。其中,各因素交互作用对酶解转化率的影响顺序分别为：AC＞BC＞AB。

2.3.3 影响酶解转化率的响应面分析

以酶解转化率为响应指标值,对纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等3个因素进行响应面分析,其相应的响应面和等高线图如图4所示。从图4可直观地看出,3个因素之间的交互作用对酶解转化率的影响。圆形表示两者之间的交互作用不显著,而椭圆表示两者之间的交互作用显著。由图4可知,半纤维素酶和果胶酶之间的交互作用显著(P＜0.05),而纤维素酶和果胶酶之间的交互作用较显著(P＜0.01),纤维素酶和半纤维素酶之间的交互作用不显著(P＞0.05)［22-25］。

通过对酶解转化率的回归模型进行多项数学解逆矩阵以及相关的数学分析,得到在糠醛渣在酶解时的最优加酶组合为96%纤维素酶、2%半纤维素酶、2%果胶酶(添加量为30 mg酶蛋白/g葡聚糖),在此酶解条件下,酶解转化率的理论预测值为78.01%,平行3次试验,测定的酶解转化率的平均值为78.81%,与预测值相差仅为0.60%。所以,采用Mixture设计法优化得到的酶解加酶量的参数准确可靠。

图4 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的交互作用对酶解转化率影响的响应面及等高线图Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase,hemicellulase and pectinase addition on enzymatic conversion rate

2.4 水洗对糠醛渣酶解的影响

糠醛渣在预处理过程中会产生一些由木质素衍生而来的酶解抑制物,而水洗过程可以去除一部分抑制物,这样水洗过程会对酶解的效果产生一定的影响。按照1.3.2的实验方法,通过单因子实验,研究了水洗过程对10%、15%这两种底物浓度的糠醛渣酶解的影响,结果见图5。

图5 水洗对糠醛渣酶解的影响Fig.5 Effect of water washing on enzymatic hydrolysis of furfural residue

由图5可知,10%、15%的糠醛渣水洗之后,酶解转化率有明显的提高,其中15%的糠醛渣通过水洗后酶解转化率达到了90.21%,相比于未水洗的糠醛渣酶解转化率提高了18.23%。因为在酶解过程中,木质素会对纤维素酶有很大程度上的无效吸附,从而会影响糠醛渣的酶解过程,使得葡萄糖的转化率不太高。通过水洗过程,可以大大降低木质素对纤维素酶的无效吸附。同时,木质素来源的纤维素酶抑制物也可大部分被去除。糠醛渣本身呈酸性,含有酶解抑制物,水洗过程也能去除一部分酶解抑制物,这使得葡萄糖的酶解转化率明显提高,所以水洗过程对糠醛渣的酶解转化率提高有一定的帮助［26］。

2.5 SSF条件优化正交试验结果

正交试验结果见表3。由表3可知,其中各因素的影响顺序为：酶用量＞发酵时间＞反应温度＞pH。糠醛渣SSF最佳工艺条件为发酵时间96 h,反应温度34℃,pH 4.6,酶用量30 mg酶蛋白/g葡聚糖,在此最佳条件下,乙醇的理论转化率高达88.64%。

表3 同步糖化发酵条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of simultaneous saccharification fermentation

孙亚东等［27］利用过碱化处理糠醛渣进行同步糖化发酵研究认为发酵罐中发酵时间在27 h时,乙醇的转化率达到最大值,为72.33%,此时的乙醇浓度为7 g/L左右。虽然本研究的摇瓶同步糖化发酵中,发酵时间在72～96 h之间,乙醇转化率才达到了最大值,但是本研究的最大乙醇浓度和转化率要远远高于前者,可能是预处理的方式导致的。

3 结论

原料的成分分析表明,糠醛渣含纤维素47.35%,含木质素39.81%,含半纤维素1.57%,糠醛渣纤维素含量非常高,并且糠醛渣自身纤维素与半纤维素的结构已经被破坏,更容易进行酶解和发酵,是作为生物质能源的理想原料。

糠醛渣经过AHP预处理后,酶解的转化率升高明显,10%底物浓度的糠醛渣24 h的酶解转化率为96.46%,比未预处理的糠醛渣转化率提高了37.44%。而水洗过程也能在一定程度上提升糠醛渣的酶解转化率,水洗之后,15%底物浓度的糠醛渣24 h的酶解转化率为90.21%,比未水洗的糠醛渣转化率提高了18.23%,说明在水洗过程中,能够去除部分酶解抑制物,而且能够降低木质素对纤维素酶的无效吸附作用。

通过Mixture设计并优化酶解的最优加酶量,建立回归模型,通过响应面数据分析,确定了酶解的最优加酶量,即96%纤维素酶、2%半纤维素酶、2%果胶酶。

糠醛渣摇瓶同步糖化发酵的优化工艺为：反应温度38℃,pH 4.6,酶用量30 mg酶蛋白/g葡聚糖。在此优化条件下,96 h乙醇的理论转化率高达88.64%,为糠醛渣发酵罐试验提供了一定的理论基础。

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