小曲酒酿造废水中高粱红色素的分离纯化工艺研究

向明锋,罗 璇,沈瑞敏*,邓 凯

(武汉设计工程学院 食品与生物科技学院,湖北 武汉 430205)

随着人们对食品安全和环保意识的增强,天然色素因其安全无毒已日益深入人心,合成色素被天然色素所取代是大势所趋［1］。高粱红色素是一种天然黄酮类色素,含多个酚羟基［2］,具有很强的抗氧化活性,且有生津止渴,消炎解热,扩张血管,降低血糖、血压,减轻疲劳等作用［3］。广泛应用于食品着色、化妆品、印染和医药行业［4-6］。

高粱红色素大多从高粱籽实壳或叶鞘中获得,而高粱在我国通常作为小曲酒的生产原料。小曲酒生产过程中会排出大量有机废水,主要来自于白酒车间酒糟水排污口、泡粮水排污口和闷水排污口［7］,废水中富含大量的高粱红色素,直接排放既是资源的浪费又是环境污染的源头［8-9］。如何对废水中的有效成分加以回收利用是解决问题的关键,且目前对废水中高粱红色素的利用还未见报道。本试验以小曲酒加工废水为原料,用大孔树脂吸附耦合硅胶柱层析法分离纯化高粱红色素,以期为提高酿酒行业的产品附加值提供参考［10］。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小曲酒酿造废水：由湖北劲酒有限公司枫林酒厂提供；大孔树脂HPD100、大孔树脂HPD400、大孔树脂HPD600、大孔树脂HPD722、大孔树脂HPD826、大孔树脂X-5：仓州宝恩化工有限公司；硅胶(200～300目)：青岛海洋化工厂；高粱红色素标品(纯度90%)：德国三颗星食品物料公司；体积分数95%乙醇(AR)：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722型可见分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司；FA2004B型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；6HL-2S型恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；玻璃层析柱(600×60 mm、250×40 mm、200×10 mm)：上海上邦玻璃仪器有限公司；DZF-6020A真空干燥箱：天津工兴实验室仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

小曲酒酿造废水→大孔树脂吸附→大孔树脂层析柱洗脱→色素洗脱液→浓缩→干燥→色素粗品→干法上样硅胶柱→硅胶层析柱洗脱→分段收集洗脱液→干燥→检测计算

1.3.2 大孔树脂纯化方法

大孔树脂的选型：根据高粱红色素的性质,选择HPD100、HPD400、HPD600、HPD722、HPD826、X-5六种型号的大孔树脂进行静态吸附和解吸实验,并计算吸附率和解吸率,选取合适型号的大孔吸附树脂。

吸附容量的确定：取50 mL预处理过的选定树脂装柱,进行动态吸附实验。每10 mL流出液分段收集并分别检测高粱红色素含量,做动态吸附泄露曲线,确定树脂的最佳吸附容量。

吸附液pH值的确定：取4份50 mL预处理过的选定树脂装柱,在相同吸附速率和和上述最佳吸附容量条件下,分别调节吸附液pH值为5、6、7、8进行动态吸附,计算吸附率,考察不同的吸附液pH值对吸附效果的影响。

吸附速率的确定：取5份10 mL预处理过的选定树脂装柱,按上述所得吸附容量和吸附液pH值进行动态吸附实验。用恒流泵控制吸附液流速分别为2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h、6 BV/h,计算吸附率,考察不同的吸附速率对吸附效果的影响。

除杂水用量的确定：取50 mL预处理过的选定树脂装柱,按上述最优条件对吸附液进行动态吸附,吸附完成后用蒸馏水在6 BV/h洗脱速率条件下对吸附柱进行洗脱除杂,并每50 mL分段收集水洗脱液,分别检测高粱红色素含量,作除杂洗脱曲线,确定最适除杂水用量。

洗脱剂浓度的确定：取50 mL预处理过的选定树脂装柱,按上述最优条件进行动态吸附、除杂后,依次用4 BV体积分数分别为10%、30%、50%、70%、80%、95%的乙醇溶液按乙醇体积分数从小到大对选定树脂进行梯度洗脱,分别检测不同浓度洗脱液中高粱红色素的含量,确定最适洗脱剂浓度。

洗脱剂用量的确定：取50 mL预处理过的选定树脂装柱,按上述最优条件进行动态吸附、除杂,然后用最佳浓度的洗脱剂进行动态洗脱,每10 mL分段收集洗脱液,分别检测高粱红色素含量,作洗脱曲线,确定最适洗脱剂用量。

洗脱速率的确定：取10 mL预处理过的选定树脂5份,按上述最优条件进行动态吸附、除杂,然后用上述最佳洗脱剂浓度和最佳洗脱剂用量进行动态洗脱。控制洗脱速率分别为2 BV/h、4 BV/h、6 BV/h、8 BV/h、10 BV/h,计算解吸率,考察洗脱速率对洗脱效果的影响。

1.3.3 硅胶柱层析纯化方法

流动相的确定：根据高粱红色素的极性,选择不同体积比的石油醚和乙酸乙酯混合展开剂进行薄层层析实验,测定不同展开剂的比移值(rate of flow,Rf),确定最适硅胶柱层析的流动相。

流动相收集液的确定：准确称取200～300目硅胶［12］50g进行装柱,取0.2 g经大孔吸附树脂纯化后的高粱红色素产品干法上样,进行硅胶柱层析二级纯化。用上述确定好的流动相,以2 BV/h的洗脱速率洗脱。每10 mL流动相分段收集,并分别检测高粱红色素的含量,作硅胶柱层析洗脱曲线,确定目标收集液范围。

1.3.4 验证实验

比较直接浓缩干燥小曲酒加工废水、最佳纯化条件经大孔树脂一级纯化高粱红色素、最佳纯化条件下经大孔树脂耦合硅胶柱层析二级纯化高粱红色素3种工艺条件下高粱红色素产品的纯度和回收率,衡量其经济价值。

1.3.5 测定方法

高粱红色素测定：按照参考文献［11］的方法。吸附率、解吸率、回收率的计算公式如下：

式中：C0为吸附前原液的质量浓度,mg/mL；C1为吸附后流出液的质量浓度,mg/mL；C2为解吸液的质量浓度,mg/mL；C3为除杂液的质量浓度,mg/mL；V0为吸附前原液的体积,mL；V1为吸附后流出液的体积,mL；V2为解吸液的体积,mL；V3为除杂液的体积,mL。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂纯化工艺条件优化

2.1.1 大孔树脂的选择

图1 不同型号大孔树脂对高粱红色素的静态吸附率及解吸率的影响Fig.1 Effect of different type of macroporous resins on static adsorption rate and desorption rate of sorghum red pigment

由图1可知,大孔树脂的静态吸附率大小分别是HPD400＞X-5＞HPD100＞HPD826＞HPD600＞HPD722；静态解吸率大小分别是HPD600＞HPD722＞HPD826＞X-5＞HPD400＞HPD100。其中HPD600和HPD722的吸附率分别达到88.5%和87.5%,解吸率分别达到86.6%和86.2%,吸附率和解吸率都较高。继续将这两种树脂用适量清水浸泡,发现HPD722的漂浮量明显大于HPD600,说明HPD722树脂较HPD600树脂易破裂,机械稳定性较差。综合考虑选择HPD600型树脂对废水中的高粱红色素进行一级纯化最为合适。

2.1.2 吸附容量的确定

图2 HPD600大孔树脂动态吸附曲线Fig.2 Dynamic adsorption curve of HPD600 macroporous resins

由图2可知,随着吸附量的增加流出液中高粱红色素的泄露量也逐渐增加,最终接近上样液的浓度,说明吸附量越大高粱红色素的损失率也越大,当树脂达到饱和时将不再对高粱红色素进行吸附。吸附量＜1 BV时高粱红色素几乎不泄露；吸附量从1.2 BV增至2.4 BV时高粱红色素泄露量急剧增加；当吸附量＞2.4 BV后泄露量一直较大,树脂接近饱和,在吸附量达到3.4 BV时树脂达到完全饱和。考虑回收率和生产效率,吸附容量应选择吸附容量较大而泄漏量较小的,泄漏量急剧上升的2/3处左右最为合适,故选择最适吸附容量为2 BV。

2.1.3 吸附液pH值对吸附效果的影响

图3 吸附液pH值对吸附效果的影响Fig.3 Effect of adsorption solution pH on absorption efficiency

由图3可知,pH值对HPD600树脂的吸附效果有较大影响。随着pH值的增加,吸附率先增加,当pH值达到7后吸附率变化趋于平缓。说明在酸性条件下,HPD600树脂对高粱红色素的亲和力下降,吸附率下降,而在pH值为7～8时吸附性能较好。这和高粱红色素的结构有关［13］,高粱红色素既含呈酸性的酚羟基,又含呈碱性的酮式羰基,导致高粱红色素在水溶液中的pH值为7～7.5,故吸附液pH值为7～8范围内树脂对高粱红色素吸附效果最佳。考虑到废水原液pH接近7,且在pH值为7时高粱红色素溶液清亮、鲜艳［14］。选择最佳吸附液pH值为7。

2.1.4 吸附速率对吸附效果的影响

图4 吸附速率对吸附效果的影响Fig.4 Effect of adsorption rate on absorption efficiency

由图4可知,HPD600的吸附率随吸附速率的增加逐渐减小,且吸附速率从1BV/h增至3BV/h时吸附率变化不大,而吸附速率增至3 BV/h后吸附率急剧下降。这是因为吸附速率慢有利于树脂对色素的吸附,而吸附速率过快会导致部分高粱红色素还没来得及被树脂吸附便随溶液流出柱子。考虑到吸附速率过慢会降低生产效率,为了兼顾吸附率和生产效率选择吸附速率3 BV/h为宜。

2.1.5 除杂用水量对除杂效果的影响

图5 除杂水用量对除杂效果的影响Fig.5 Effect of edulcoration water volume on edulcoration efficiency

水洗除杂除掉的主要是树脂缝隙中残留的蛋白质和多糖等大极性物质,但同时会有少部分过饱和的高粱红色素残留其中。水洗除杂过程中这部分高粱红色素会随着蛋白质和多糖一起被洗脱下来,而被树脂有选择性吸附的大部分高粱红色素则不会被洗脱。由图5可知,随着除杂用水量的增加,高粱红色素的含量逐渐减少,当除杂用水量达到5 BV时,流出液中高粱红色素含量基本为0。而蛋白质、多糖等杂质的极性高于高粱红色素的极性,说明此时树脂缝隙中的蛋白质、多糖等极性杂质也已被除完,因此选择5 BV为最适除杂用水量。

2.1.6 洗脱剂浓度对洗脱效果的影响

表1 洗脱剂浓度对洗脱效果的影响Table 1 Effect of eluent concentration on eluting effect

由表1可知,体积分数80%的乙醇对高粱红色素的累计洗脱率可达93.2%,继续增加洗脱剂浓度,累计洗脱率变化不大。考虑洗脱效果和经济因素,选择体积分数80%的乙醇溶液为最适洗脱剂浓度。

2.1.7 洗脱剂用量对洗脱效果的影响

图6 洗脱剂用量对洗脱效果的影响Fig.6 Effect of eluent volume on eluting effect

由图6可知,高粱红色素含量随着洗脱剂用量的增大先增加后减小。这是因为开始的洗脱液主要为除杂后残留在树脂柱缝隙中的水(其色素含量极少),随着洗脱的进行,洗脱剂很快将树脂柱中吸附的大量高粱红色素洗脱出来,直至高粱红色素被完全洗脱。洗脱液用量＞2 BV时,高粱红色素的含量基本为零,说明此时高粱红色素刚被洗脱完全。因此选择2 BV洗脱液为最适洗脱剂用量。

2.1.8 洗脱速率对洗脱效果的影响

由图7可知,HPD600的解吸率随洗脱速率的增加逐渐减小,且洗脱速率从2 BV/h增至6 BV/h时,对洗脱速率的影响不大；但当洗脱速率增至6 BV/h后,洗脱率急剧下降。这是因为洗脱速率越小,越有足够的时间让高粱红色素从大孔树脂网孔结构中解吸出来；当洗脱速率增加到一定程度时,部分高粱红色素来不及从树脂中解吸,洗脱剂就已流出柱外。兼顾生产效率和洗脱率,选择6 BV/h的洗脱速率最合适。

图7 洗脱速率对洗脱效果的影响Fig.7 Effect of elution rate on eluting effect

2.2 硅胶柱层析纯化条件优化

2.2.1 硅胶柱层析流动相的确定

表2 不同流动相的Rf值Table 2 Rf value of different mobile phases

由表2可知,流动相中随着石油醚比例的增大Rf值越来越小,当流动相为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1时的Rf值为0.32,在0.2～0.4之间［15］,能较好的将高粱红色素和其他杂质分离开来。所以,选择石油醚∶乙酸乙酯=4∶1的展开剂作为流动相较合适。

2.2.2 流动相收集液体积的确定

图8 硅胶柱层析洗脱曲线Fig.8 Elution curve of silica gel column chromatography

由图8知,随着洗脱过程的进行,分段收集的流动相中高粱红色素含量先增加后减少,在流动相收集液体积2～3 BV时出现峰值。这是因为不同组分在流动相中的展开速度不同,达到了分离的目的。根据洗脱峰值,选择流动相收集液体积2～3 BV的洗脱液进行干燥。

2.3 验证实验结果

通过检测计算,验证实验结果如表3所示。

表3 验证实验结果Table 3 Results of verification experiments

由表3可知,经过大孔吸附树脂耦合硅胶柱层析两级纯化后,将废水中高粱红色素的纯度从10.9%提高至90%,总回收率达67.2%,经济效益明显。

3 结论

以小曲酒酿造废水为原料,用大孔树脂耦合硅胶柱层析法对废水中的高粱红色素进行纯化回收,工艺简单可行。

大孔树脂最佳纯化条件为大孔树脂型号选择HPD600,吸附容量为2 BV,吸附液pH值为8,吸附速率为3 BV/h,5 BV水洗除杂,洗脱剂浓度为体积分数80%的乙醇,洗脱剂用量为2 BV,洗脱速率为6 BV/h,此条件下得到高粱红色素产品的纯度为78.7%,回收率达85.7%。

硅胶柱层析最佳纯化条件为200～300目硅胶装柱,样品和吸附剂质量比为1∶50,干法上样,流动相为v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)=4∶1,目标收集液为2～3 BV段的流动相收集液,得到高粱红色素纯为90%,回收率达78.4%。

经过大孔吸附树脂耦合硅胶柱层析两级纯化后,将废水中高粱红色素的纯度从10.9%提高至90%,总回收率达67.2%,经济效益明显。

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