稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵的影响

刘子强,张 震,蔡萌萌,户红通,陈 宁,徐庆阳*

(天津科技大学 生物工程学院 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津300457)

色氨酸产业近几年来发展迅猛,是因其在生命体生长发育和代谢系统中不可替代的重要作用而逐渐被人们开发利用［1-3］。现在色氨酸在饲料添加剂、食品和医药方面都有非常广泛的应用［4-6］。色氨酸的生产方法也由刚开始的化学合成法、酶法、微生物转化法到现在几乎所有色氨酸产业都采用的微生物发酵法,因为其原材料易得、工艺步骤相对简单,产量高,所以非常适合大规模生产［7-9］。虽然微生物发酵色氨酸产量高、效益好,但是在生产工艺方面仍然存在以下问题。

色氨酸发酵在工业上常采用65%的浓淀粉糖流加补料(实验室采用质量分数为80%的葡萄糖液进行替代),淀粉糖在制作时遇高温发生反应使糖液颜色变深不仅导致培养基的碳源质量降低,也给后续提取工作带来困难。而且发酵中期时当装填系数达到一定程度后,操作人员会放出部分料液以维持发酵罐正常装填系数,放出的料液直接送往提取车间进行产品提取。这时料液中还含有未利用的培养基和具备高产酸活力的菌体,提前将其放出会造成菌体活力的浪费,导致最终色氨酸产量降低。再有,浓糖补料的缺点在于不容易混合均匀,导致罐内局部糖浓度分布不均,局部浓度过低会影响菌体正常生长,局部浓度过高则会使菌体合成副产物乙酸。乙酸浓度过高会抑制细胞生长及重组蛋白合成,制约着色氨酸产量和糖酸转化率的进一步提升［10］。这些都一定程度上制约着发酵生产。

为了解决以上存在的问题,本研究在现有的发酵工艺基础上对发酵过程进行优化,利用稀浓度葡萄糖糖液(简称为稀糖)流加发酵,降低成本损耗,减少色素杂质的添加；发酵中期对发酵液重新分配,将部分料液转入其他罐中进行发酵,避免中期放料,减少菌体和培养基营养成分的浪费,提高设备利用率；以期为色氨酸发酵和工业化生产提供新的工艺思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

L-色氨酸工程菌大肠杆菌(Escherichiacoli)TRTH：天津科技大学代谢工程研究室保藏菌株。

1.1.2 培养基［11-13］

种子培养基：葡萄糖35 g/L,酵母粉2 g/L,一水合柠檬酸1.6 g/L,硫酸铵1.2 g/L,磷酸氢二钾5.6 g/L,七水合硫酸镁1.6 g/L,维生素B1(vitamin B1,VB1)1.3 mg/L,七水合硫酸亚铁2.8 mg/L,一水合硫酸锰1.2 mg/L,生物素(vitamin H,VH)2 mg/L,盐酸四环素50 mg/L。

发酵培养基：葡萄糖10 g/L,酵母粉2 g/L,一水合柠檬酸2 g/L,硫酸铵1.6 g/L,磷酸氢二钾7.5 g/L,七水合硫酸镁2 g/L,七水合硫酸亚铁75 mg/L,维生素B族混合物(VB1、VB3、VB5、VB7)0.1 mL/L,微量元素混合物1 mL/L。

1.1.3 化学试剂

L-色氨酸：北京索莱宝科技有限公司；对二甲氨基苯甲醛：上海三爱思试剂有限公司；亚硝酸钠：天津市北方天医化学试剂厂；硫酸：天津化学试剂二厂；一水合葡萄糖：西王药业有限公司邹平分公司；酵母粉：英国OXOID公司；一水合柠檬酸、一水合硫酸锰：国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁：天津市光复科技发展有限公司；生物素(VH)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸四环素：上海麦克林生化科技有限公司；DF-8016生物发酵专用消泡剂：东莞市德丰消泡剂有限公司。实验室所用化学试剂均为分析纯及生化试剂。

1.2 仪器与设备

LRH-250-A生化培养箱：广东省医疗器械厂；LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；TG16-W微量台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；30 L在位灭菌发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；KQ-C型全自控蒸汽发生器：上海奉贤协新机电厂；LC-20A高效液相色谱仪(high performanceliquid chromatograph,HPLC)：岛津仪器(苏州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 稀糖分罐发酵工艺流程

本工艺采用三罐一组进行分罐发酵,罐A、罐B接种后在发酵前期仍采用现有发酵方式(葡萄糖浓糖流加,糖液浓度为80%)进行发酵,发酵至中期(发酵时间为20 h前后)时,将罐A和罐B两罐1/3料液打入已消毒的罐C中,实现料液分罐；分罐结束后流加糖浓度为40%的稀糖继续进行发酵,实现稀糖补料。具体操作要点如下：

首先将菌种扩培接到5 L种子罐中进行种子发酵,发酵约10 h,在此期间将A、B两个30 L发酵罐在位空消,灭菌条件为121℃、20 min,加入发酵培养基并加水定容至15 L后在位实消,灭菌条件为115℃、15 min；待种子罐菌液菌体浓度OD600nm值处于10～12区间时接入已在位实消好的30 L发酵罐A和B中,保持36.8～37℃发酵,接菌量为10%。这时需要将罐C在位空消,灭菌条件为121℃、20 min,在温度还未下降时通入无菌空气,保持罐处于正压状态；当发酵中期发酵液体积(将搅拌和通气因素考虑在内)超过发酵罐容积的80%后,将罐A和罐B中的1/3料液经过无菌管道利用压力差打入30 L发酵罐C中,三罐所流加的糖浓度均为40%的稀糖,继续发酵。分罐发酵工艺流程示意图如图1。

图1 稀糖分罐发酵工艺流程示意图Fig.1 Schematic diagram of fermentation process of diluted glucose with multiple fermenters

1.3.2 L-色氨酸发酵培养方法［14-15］

5 L发酵罐一级种子培养：在无菌环境下取适量无菌生理盐水于6支活化好的斜面中,于37℃培养12 h,菌液打散后接入装有4 L种子培养基的5 L自动数控发酵罐中,初始通气量为1 L/min,初始搅拌转速为200 r/min,通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2,培养温度维持在36.8～37.0℃,通过一定脉冲比流加消泡剂消泡；当培养菌体浓度的OD600nm值为10～12时,即可接入发酵培养基。

30 L发酵罐发酵培养：在30 L发酵罐中以10%接菌量接入15 L发酵培养基中,初始通风量2 L/min,初始转速300L/min,培养温度36.8～37.0℃,通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2,通过一定脉冲比流加消泡剂消泡；当罐内系统糖浓度＜0.1%时,以适当脉冲将液糖流加进罐内,维持罐内糖浓度≤0.1%；在发酵周期内对发酵液每2 h取样一次测定其菌体OD600nm值、生物量、L-色氨酸产量,并记录发酵系统内pH、OD600nm值、温度、通风、料液体积以及糖液流加量等其他参数,直至发酵结束。

1.3.3 检测方法

pH的测定：采用pH 6.4～8.0的精密pH试纸及发酵罐附带的pH电极进行测定。

溶氧值测定：利用发酵罐附带的溶氧电极测定发酵过程的溶氧水平。

菌体浓度测定：吸取适量发酵液稀释至适当倍数,测定其在波长600 nm处的吸光度值,以吸光度值为0.2～0.9最佳,即吸光度值×稀释倍数即为菌体浓度。

菌体生物量测定［16］：菌体生物量以菌体干质量表示,取10 mL发酵液,10 000 r/min离心20 min,将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中,80℃干燥至恒质量,用分析天平称质量,重复3次取平均值。

L-色氨酸含量测定：采用对二甲氨基苯甲醛法［17］,在比色管中加入1 mL(1 g/L)L-色氨酸溶液(或已处理好的发酵液)与9 mL(3 g/L)对二甲氨基苯甲醛溶液,混合后在沸水中加热2min,然后加入1滴亚硝酸钠溶液,再继续加热3min,随后取出用冷水浴冷却,以试剂作空白,在波长600nm处测定其吸光度值。以L-色氨酸含量(C)为纵坐标,吸光度值(A)为横坐标,得到L-色氨酸标准溶液工作曲线方程：C=23.56A,相关系数为R2=0.997 2,将发酵液样品的吸光度值代入该工作曲线方程,即可得出发酵液中L-色氨酸的含量。乙酸含量的测定：采用高效液相色谱仪检测发酵液中乙酸的含量［18］。发酵液预处理：取1 mL发酵液于1.5 mL离心管中,13000r/min离心2min,取上清液稀释10倍,然后用0.22μm微孔滤膜过滤,置于4℃冰箱中待测。

色谱条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm,9μm),0.05 mol/L硫酸缓冲液洗脱,柱温30℃,流速0.5 mL/min,检测波长210 nm。

发酵液中葡萄糖及谷氨酸含量测定：利用生物传感分析仪测定发酵液中的葡萄糖、谷氨酸含量。取发酵液1 mL于1.5 mL离心管中,13 000 r/min离心2 min,取10μL上清液于990μL去离子水中,稀释100倍,用50μL进样针取25μL稀释液进样检测后直接读数即为所测样品含量［18］。

L-色氨酸发酵整个发酵周期的糖酸转化率计算公式如下：

式中：L-色氨酸含量为发酵结束时发酵液内的L-色氨酸含量,g/L；发酵液体积为发酵结束时该罐内所得发酵液体积,L；耗糖量为直至发酵结束时所流加总糖液核算后(除去葡萄糖所含结晶水和溶剂水)所得的纯葡萄糖量,g。

2 结果与分析

2.1 稀糖分罐发酵对菌体生物量及L-色氨酸产量的影响

为了验证稀糖分罐发酵工艺的可行性和最终的生产效果,本研究利用5 L全自动发酵罐培养一级种子、30 L自动数控发酵罐进行发酵试验,在30 L发酵罐发酵过程中每隔2 h测定发酵液中菌体干质量和L-色氨酸产量结果如图2所示。

图2 发酵工艺对菌体生物量(A)和L-色氨酸产量(B)的影响Fig.2 Effect of fermentation process on mycelia biomass(A)and L-tryptophan yield(B)

在发酵时间为20h时进行分罐操作,此时罐A发酵液体积为18.2 L、罐B发酵液体积为18.8 L；利用压力差分别将罐A和罐B中的发酵液均分到已经准备好的罐C中,三罐同时继续开始发酵,控制糖流加速率保持不变,但所流加的糖浓度由80%改为40%。

由图2A可知,在分罐前后菌体生物量的增长速率没有明显变化,菌体由浓糖流加变为稀糖后几乎不需要适应就能正常生长,最终积累的生物量稍高于普通发酵工艺,最高达到了44.84 g/L,三罐平均生物量为44.31 g/L,较普通工艺增长了5.4%。且本工艺中菌体对数生长期要比传统发酵工艺长2 h左右,这表明稀糖分罐发酵工艺有利于菌体生长,且拉长了菌体对数生长期。这在工业生产中有一定推广价值。在工业生产中,由于发酵罐容积很大,补料通常采用罐顶单路流加补料,使用浓糖流加虽然可以避免由于补料增加发酵液体积,但很容易导致罐内料液混匀过慢造成糖浓度分布不均。局部糖浓度过高导致菌体乙酸大量产出,抑制菌体生长,使产量下降；而罐底等部分糖浓度过低,菌体缺乏碳源,处于高溶氧状态,使菌体易老化,产酸速率降低,糖酸转化率下降。而采用稀糖发酵就可以在一定程度上减轻上述情况对发酵造成的影响。

由图2B可知,从产量方面看,稀糖分罐发酵三罐的L-色氨酸产量基本相同,其中罐B终产量最高,为44.1 g/L；三罐平均产量为43.82 g/L。菌体在10～28 h时产L-色氨酸水平较高。发酵后期产酸速度缓慢,单批次平均最终产量较普通发酵增长了9.9%；普通发酵最终的色氨酸产量为39.88 g/L,菌体28 h后产酸进入停滞期,发生这种情况的原因是普通发酵在发酵中后期由于乙酸的积累抑制了菌体的生长,且使菌体活力大大下降,导致了产酸停滞期过早的出现。稀糖分罐发酵工艺在初始培养基体积不变、补糖速率不变的情况下分罐后采用低浓度的糖补料,势必就会增加发酵液的体积,这样不仅有利于菌体对氧的吸收,还可以有效稀释发酵液中副产物乙酸的含量,有研究表明,当乙酸含量＞2 g/L时,菌体的生长就会受到抑制［10］。所以稀糖补料可以一定程度上降低乙酸积累对于菌体的毒害,从而使得菌体在发酵后期仍具有产酸活力。

2.2 稀糖分罐发酵对发酵副产物乙酸积累的影响

色氨酸在发酵培养时主要的副产物有乙酸、乳酸、谷氨酸等［1］,其中对菌体生长影响最显著的是乙酸的积累。本试验研究了发酵液样品中副产物乙酸的积累量与发酵培养时间的关系,并将新工艺与普通发酵作对比,结果见图3。

图3 发酵工艺对乙酸积累量的影响Fig.3 Effect of fermentation process on accumulation of acetic acid

由图3可知,在发酵进行到18h之后乙酸开始大量生成,这是由于随着菌体生物量的增加,发酵液内的菌体密度不断增大,菌体不能及时摄取到足够的氧气导致底物通过乙酰磷酸途径转化为乙酸,最终稀糖发酵工艺和普通发酵工艺乙酸积累量分别为3.66 g/L和6.06 g/L,副产物乙酸积累量降低了65.5%。这是由于在采用稀糖流加培养以后,稀糖的流加逐渐稀释了发酵液内乙酸的含量,从而乙酸对菌体的生长抑制和毒害作用得到了一定缓解；此外由于稀糖流加的稀释作用使得菌体更容易摄取氧气,这在一定程度上也减缓了菌体合成乙酸。结果表明,采用稀糖发酵工艺可有效缓解副产物乙酸对菌体带来的毒害和抑制,从而有利于L-色氨酸产量的提高。

2.3 稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵工艺糖酸转化率的影响

稀糖分罐发酵工艺是将相同控制条件的两个罐内的部分发酵液在同一时刻打入另外一个相同容积的发酵罐内,之后均采用稀糖流加补料方式继续发酵,并与普通发酵进行对比,检测各罐发酵液参数,结果如表1所示。

表1 不同发酵工艺参数结果对比Table 1 Comparison of different fermentation process parameters results

根据表1中所列各罐参数,最终可核算出每罐最终糖酸转化率以及合计后的平均糖酸转化率,结果如图4所示。由图4可知,罐A、B、C以及普通发酵罐的最终糖酸转化率分别为19.8%、20.8%、19.7%和17.8%。稀糖发酵工艺合计后平均糖酸转化率为20%,比普通发酵工艺提高了12.36%。由此可知,稀糖分罐发酵工艺在一定程度上可以降低工艺成本、提高菌体利用率和糖酸转化率,从而在工业生产上具有一定推广价值。

图4 不同发酵工艺条件下的糖酸转化率Fig.4 Glucose acid conversion rate of under different fermentation process

3 结论

采用稀糖分罐发酵工艺,研究了在该工艺条件下稀糖分罐发酵对色氨酸发酵过程中菌体生物量、L-色氨酸产量、糖酸转化率以及副产物乙酸积累量的影响。结果表明,采用稀糖分罐发酵工艺,单批次平均菌体生物量、L-色氨酸产量、糖酸转化率分别为44.31 g/L、43.82 g/L、20%,较普通工艺分别提高了5.4%、9.9%和12.36%,可以有效提高色氨酸产品的产量和糖酸转化率；乙酸积累量为3.66 g/L,较普通工艺下降65.5%,说明利用稀糖流加补料可以稀释发酵液中的乙酸浓度,减少其对菌体的毒害作用；采用稀糖分罐发酵工艺,可以避免发酵中期排料,避免了菌体活力的浪费,提高了菌体利用率；采用稀糖分罐发酵工艺,在一个发酵周期内可利用一套种子培养系统供应三个发酵罐进行发酵,收获发酵液总产酸量达到了2 274.3 g,是相同发酵周期内普通工艺酸量的2.9倍,节省了设备和原材料成本,提高了设备利用率和工作效率,也减轻了工作量。在工业生产方面有一定实用性和推广价值。

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