红糖醋不同发酵阶段产物有机酸变化及抗氧化活性研究

李腾宇，郭 艳，葛含静，张 莉，王双喜，吴 进，张 爽，李志西*

（1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西学前师范学院 生命科学与食品工程学院，陕西 西安 710061；3.西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100）

红糖也称为黄糖、黑糖，是甘蔗汁用石灰法清净处理后，直接煮成不经分蜜的棕红色或黄褐色的食糖[1]。红糖保留了甘蔗中大部分营养成分，含有多种人体必需氨基酸、有机酸和微量元素，还含有一些生理活性的物质，如多酚类化合物、植物甾醇、高级烷醇、叶绿素、矿物质、维生素等[2]。已有研究表明，红糖中可提取出13种酚类物质，有较强的抗氧化活性[3]。传统中医学认为，红糖性温、味甘、入脾，具有益气补血、健脾暖胃、缓中止痛、活血化瘀的作用。国外也有研究发现，红糖有多种保健作用，如抗毒性、抗癌性，对高血压和糖尿病有一定的预防作用[4]。目前，国内外对红糖中活性物质及其生理功能方面的研究较多[5]，而对红糖醋的开发及其功能性的研究较少[6-7]。本研究以红糖为原料，经液态深层发酵法酿造红糖醋，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析其不同发酵阶段产物的有机酸组成，福林酚法和分光光度法检测不同发酵阶段产物的总多酚和总黄酮含量，测定其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和总还原力，分析红糖醋不同发酵阶段产物（红糖液、红糖酒醪和红糖醋）有机酸组成、总多酚、总黄酮类含量及抗氧化活性的变化，探究发酵过程中总多酚、总黄酮与抗氧化关系，以期为红糖液态醋的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红糖：市售；香醋：石家庄珍极酿造集团有限责任公司；白醋：加加食品集团股份有限公司；酵母菌：安琪酵母股份有限公司；沪酿1.01醋酸菌：上海酿造一厂；草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀（均为色谱纯）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；乳酸（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；抗坏血酸、氢氧化钠、硝酸钠、硝酸铝（均为分析纯）：广州华大化学试剂有限公司；没食子酸（分析纯）：美国Aladdin公司；DPPH自由基：梯希爱化成工业发展有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）：科邦生物科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AL104电子分析天平：梅特勒-托利多称量仪器有限公司；WYT-4型手持糖量计：绍兴市亿纳仪器制造有限公司；0-100酒精计：上海医用仪表厂；752型可见分光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HSY3-SP水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；H2050R型台式离心机：湘仪离心机仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；水相针式过滤器（0.22 μm）：上海楚定分析仪器有限公司；150A型恒温培养箱：天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 红糖醋酿造工艺流程及操作要点

操作要点：12%的红糖液，接种0.05%高活性酒用干酵母，搅拌均匀，在28℃恒温箱内发酵，当酒精度达到6%vol以上且不再上升时，酒精发酵结束。在红糖酒醪中接入活化的醋酸菌液（酒醪与菌液体积比10∶1），于（34±1）℃的条件下，采用实验室小型自吸式发酵罐进行通气发酵，当总酸含量达到5.0 g/100 mL时，醋酸发酵结束。

1.3.2 有机酸组分测定[8]

采用高效液相色谱法测定样品中有机酸的含量，其色谱条件如下：Wondasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相，0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4，缓冲溶液（pH 2.8）过0.22 μm水系滤膜；流速0.7 mL/min；检测波长210 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。样品处理：取一定量的样品迅速高速冷冻离心（10 000 r/min、10 min），上清液用流动相稀释10倍，过0.22 μm孔径滤膜，滤液上机分析（进样10 μL），用外标法定性定量。

1.3.3 总多酚含量的测定[9]

总多酚含量的测定采用福林酚法。以没食子酸为标准品，没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线。得标准曲线回归方程为y=0.0034x+0.0210（R2=0.995 8）。准确称取样品0.1 mL，按照标准曲线回归方程计算样品中总多酚的含量。

1.3.4 总黄酮含量的测定[10]

总黄酮含量的测定采用比色法。以芦丁为标准品，芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制绘制芦丁标准曲线。得标准曲线回归方程为y=0.181 6x+0.003 4（R2=0.997 1）。按照标准曲线回归方程计算样品中总黄酮的含量。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的测定

按照参考文献[11]测定红糖醋不同发酵阶段产物的DPPH自由基清除能力。

1.3.6 总还原能力的测定

按照参考文献[12]测定红糖醋不同发酵阶段产物的总还原能力。

1.3.7 统计分析

实验数据重复3次，利用Origin 8.5进行作图和统计，用SPSS 20数据处理软件对实验结果进行处理，结果用平均值±标准差表示，显著性差异以不同字母表示（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 有机酸组成分析

按照1.3.1所述酿造工艺制得红糖液、红糖酒醪、红糖醋。采用高效液相色谱法检测其有机酸组分与含量，10种有机酸混合标样高效液相色谱图见图1，红糖液、红糖酒醪、红糖醋中有机酸组分测定高效液相色谱图见图2～图4，含量结果见表1。

图1 10种有机酸混合标样高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 10 organic acids mixed standards

由图1可看出，各有机酸标品分离效果较好，说明选择的色谱条件适用。红糖液、红糖酒醪和红糖醋有机酸组成不同。

由图2可知，红糖液含有草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、琥珀酸。由图3可知，除红糖液含有的8种有机酸外，红糖酒醪还含有富马酸。由图4可知，红糖醋含有10种有机酸，分别是草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸和富马酸，酒精发酵和醋酸发酵过程中有机酸的变化可能由于pH的降低和酵母代谢的产物的积累。

图2 红糖液中有机酸含量测定高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids contents in brown sugar liquid

图3 红糖酒醪中有机酸含量测定高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of organic acids contents in brown sugar alcoholic mash

图4 红糖醋中有机酸含量测定高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids contents in brown sugar vinegar

由表1可知，红糖醋、红糖酒醪及红糖液分别检出10种、9种及8种有机酸，主要为乙酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酸，红糖液中琥珀酸和红糖醋中乙酸含量较高，为4 971.09 mg/L和28 273.35 mg/L。在红糖醋各发酵阶段，变化最显著的是乙酸、酒石酸，含量增加，而草酸、琥珀酸含量是降低的。此结果与向进乐等[8]对木瓜醋发酵阶段有机酸变化的研究结果略有不同。红糖发酵过程中乙酸含量呈上升趋势，主要由于乙醇含量增加，进行氧化反应，酒精发酵阶段发酵液氧气含量较少，乙酸含量略有增加，醋酸发酵阶段发酵液溶氧量大，乙酸含量显著增加，最后达28 273.35 mg/L；同时又随着发酵体系pH的不断下降，酒石酸盐溶解性增大[13]，表现出酒石酸质量浓度的显著升高；而草酸在发酵初期质量浓度为577.64mg/L，红糖酒醪阶段降至394.98 mg/L，红糖醋发酵阶段最后降至240.23mg/L。主要由于草酸与发酵液中金属离子结合成沉淀，草酸溶解度降低；琥珀酸的降低主要由于在无氧的条件下，酮戊二酸脱氢酶的缺失，琥珀酸由草酰乙酸到苹果酸，部分还原为琥珀酸。有文献报道[14]谷氨酸进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TAC）合成琥珀酸的，但在红糖中甘氨酸含量很少，平衡趋向氧化方向进行，导致琥珀酸有下降。

表1 红糖液、红糖酒醪及红糖醋的有机酸含量测定结果Table1 Determination results of organic acids contents in brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar mg/L

甲酸、苹果酸、抗坏血酸是红糖原料中主要的有机酸[15]，在红糖醋各发酵阶段发生阶段性变化。甲酸表现为降低再增加的趋势，主要由于酒精发酵阶段甲酸部分降解或被酵母利用，但同时伴随着甲醇产生[16]，在红糖醋发酵阶段甲醇氧化成了甲酸。苹果酸表现为先升高再降低的趋势，主要由于在酒精发酵阶段琥珀酸部分转化为苹果酸，但在醋酸发酵阶段由于醋酸菌的利用及氧化降解损耗了部分苹果酸[17]。

富马酸不是红糖中的主要有机酸，是酵母在发酵过程中代谢产生的[18]，表现为酒精阶段不断积累，醋酸阶段由于醋酸菌的利用或氧化降解而降低。而乳酸、柠檬酸在整个发酵过程相对稳定，变化不显著。

2.2 总多酚和总黄酮含量

不同样品的总多酚和总黄酮类物质含量测定结果见表2。

表2 红糖液、红糖酒醪及红糖醋中总多酚和总黄酮含量测定结果Table2 Determination results of total phenols and total flavonoids contents in brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar

由表2可知，红糖在发酵过程中总多酚含量和总黄酮含量有下降趋势，由红糖液总多酚含量0.937 4 mg/mL降至红糖醋0.867 1 mg/mL，总黄酮由红糖液0.495 2 mg/mL降至红糖醋的0.166 7 mg/mL，主要由于不稳定的总多酚和总黄酮类物质在发酵过程中被氧化或降解[10]，但红糖醋的总多酚和总黄酮含量远远高于香醋和白醋，表明相比于香醋和白醋，红糖醋具有更丰富的酚类和黄酮类物质。

2.3 抗氧化能力

图5 红糖液、红糖酒醪及红糖醋的DPPH自由基清除能力（A）及总还原力（B）Fig.5 DPPH free radical scavenging ability(A)and the total reducing power(B)of brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar

由图5A可知，不同发酵产物的DPPH自由基清除率随着添加量的增加而不断升高，当红糖液添加量＞30 μL时DPPH清除率达到93.8%后趋于稳定，红糖酒醪、红糖醋添加量＞40 μL之后，DPPH清除率分别达到92.99%、91.67%后趋于稳定。由图5B可知，总还原力变化趋势与DPPH自由基清除率变化趋势相同，随着添加量的增加吸光度值不断增加。样品清除DPPH自由基能力与总还原力大小为红糖液＞红糖酒醪＞红糖醋＞香醋＞白醋。

2.4 总多酚、总黄酮含量与抗氧化能力的关系

不同发酵阶段样品（红糖液、红糖酒醪及红糖醋）总多酚含量（x1）、总黄酮（x2）含量分别与DPPH自由基清除率（y1）和总还原力（y2）的线性相关分析结果见图6。

图6 红糖液、红糖酒醪及红糖醋的总多酚及总黄酮含量与DPPH清除率（A、B）和总还原力（C、D）关系Fig.6 Relationship between total phenols content or total flavonoids content and DPPH free radical scavenging ability(A,B)and the total reducing power(C,D)of brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar

由图6可知，总多酚与DPPH自由基清除率的线性回归方程为：y1=1.1197x1+0.0001，相关系数R2=0.8555，总黄酮与DPPH自由基清除率线性回归方程为y1=5.961x2+11.171，相关系数R2=0.883 0。总多酚与总还原力线性回归方程为y2=0.006 8x1+0.000 1，相关系数R2=0.907 8，总黄酮与总还原力线性回归方程为y2=0.014 9x2+0.073 6，相关系数R2=0.909 3。总酚、总黄酮质量浓度均与DPPH自由基清除率和总还原力呈极显著正相关性（P＜0.01），总多酚、总黄酮质量浓度越大，DPPH自由基清除率和总还原能力越强。结果表明，红糖醋的DPPH自由基清除率和总还原力在很大程度上受总多酚和总黄酮含量的影响。此结论与张雪村等[19-20]研究紫甘薯醋及其不同发酵阶段产物的抗氧化活性结果一致，红糖醋的总多酚和总黄酮的含量远高于对照液态发酵的香醋和白醋，所以红糖醋表现出较强的抗氧化性。

3 结论

红糖醋检出10种有机酸，分别为草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、富马酸、琥珀酸；红糖醋在发酵过程中有机酸种类及含量变化主要表现为乙酸、酒石酸含量明显增加，草酸、琥珀酸含量降低，甲酸含量先降低后升高，苹果酸、富马酸、抗坏血酸含量先升高后降低。在发酵过程中，总多酚和总黄酮含量由0.937 4 mg/mL和0.495 2 mg/mL降至0.867 1 mg/mL和0.166 7 mg/mL，主要由于部分总多酚和总黄酮类物质在醋酸发酵阶段被氧化降解。红糖醋不同发酵阶段产物以及对照组液态发酵香醋和白醋抗氧化能力的关系为红糖液＞红糖酒醪＞红糖醋＞香醋＞白醋，主要由于红糖醋不同发酵阶段产物的抗氧化能力与总多酚、总黄酮含量有很强的相关性。其中，总多酚、总黄酮含量与DPPH自由基清除率的相关系数分别为0.8555和0.8830，与总还原力的相关系数为0.9078和0.909 3。