发酵罐生产的荞麦酒营养及活性成分的研究

陈勤怡，孙亚利，2，周文美，2*，周 敏，2，姜 莹，2

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

《中国荞麦品种资源目录》中收录的荞麦资源共有2 795份[1]，荞麦作为药食同源性植物，同时兼有很高的营养价值跟药用价值[2-3]。荞麦蛋白是荞麦主要的生物活性成分[4]，并且氨基酸配比均衡[5]，荞麦蛋白与小麦蛋白之间最大差异在于清蛋白和球蛋白的含量明显高于醇溶蛋白和谷蛋白[6-8]。荞麦淀粉的糊化特性[9]与小麦、大米和玉米相似[10-11]。研究表明，甜荞直链淀粉含量为25.82%～32.67%，高于苦荞淀粉（25.5%～26.5%）[12]。荞麦淀粉具备耐消化淀粉特性，可作为糖尿病患者良好的补充食品[13-15]。荞麦中含有9种脂肪酸[16]。对调节人体血压、降低“三高”以及促进酶的催化、预防心血管疾病等都有良好的作用[17]。

随着荞麦保健食品的开发与应用[18]，荞麦酒作为现代荞麦开发的一项重要产品脱颖而出。有研究表明，荞麦酒中不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等基本营养物质，同时含有黄酮类物质、有机酸及多酚类等多种特殊功能活性物质[18]。具有降低人体血脂和胆固醇、软化血管、保护视力和预防脑血管出血等作用[19]。

本实验通过对发酵罐生产的荞麦酒中蛋白质，游离氨基酸、有机酸以及总多酚含量等营养及活性成分进行测定[20]，对荞麦酒进行综合性评价[21]。旨在开发新型资源利用方式，改善传统发酵工艺，提高荞麦中的营养因子的利用率，制备风味独特的荞麦酒[22]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

荞麦酒：实验室自制；黄酒（G-H）（五年）、黄酒（T-H）（五年）、黄酒（K-H）（五年）：市售；氨基酸标准混合液（WAKO）：日本和光药业株式会社；福林酚（Folin-Ciocalteu）（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸标准品（色谱纯）：贵州迪大生物科技有限公司；水杨酸（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；Tris（分析纯）：Beijing Solarbic Science；抗坏血酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、乳糖（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；牛血清蛋白（分析纯）：生工生物工程（上海）有限公司；高峰-α-淀粉酶（2 000 U/g）：源叶生物有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8800氨基酸自动分析仪：HITACHI（日立）公司；GTR16-2高速冷冻离心机：北京时代北利离心机有限公司；UV-2550紫外-可见光分光光度计：日本岛津仪器公司；722s可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；FA2004N分析天平：上海箐海仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯实业有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：上海浦东物理光学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 荞麦酒的发酵罐制作工艺

操作要点：

粉碎：甜荞与苦荞粉碎，过40目筛，备用。

液化：按1∶2的比例称取甜荞与苦荞粉，料液比为1∶4（g∶mL），调节pH至6.5，加入0.5%高峰-α-淀粉酶、在90 ℃条件下液化40 min。

糖化：冷却液化后的样品至室温，糖化酶添加量为5%，调节pH至5.0，在60℃条件下糖化50 min后进行灭菌。

发酵罐发酵：将灭菌后的样品加入灭菌后的发酵罐内，酵母添加量为0.6%，灌装量在总体积的2/3左右，调节罐内通气量，设置转速为100 r/min。控制罐内温度为31℃进行发酵，发酵时间为7 d。

澄清：以壳聚糖添加量为0.6g/L，皂土添加量为0.2g/L，进行澄清，澄清时间为2 d。

灌装：将澄清部分的酒液进行灌装。

灭菌：在65～70℃条件下保温12～15 min。

1.3.2 荞麦酒中可溶性蛋白质含量测定[23]

采用考马斯亮蓝法，精确吸取0、0.02 mL、0.04 mL、0.06mL、0.08mL、0.10mL标准蛋白液（1mg/mL）于6支10mL具塞试管中，分别加入0.10 mL、0.08 mL、0.06 mL、0.04 mL、0.02 mL、0 mL蒸馏水，再依次加入3 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞、混合均匀，静置2 min，在波长595 nm处测定吸光度值，以牛血清蛋白溶液质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线，得线性回归方程。

取经稀释20倍后的荞麦酒样品1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，设计三组平行实验，测定其吸光度值并根据回归方程计算出荞麦酒中可溶性蛋白质含量。

1.3.3 荞麦酒中游离氨基酸测定[24]

参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》中氨基酸测定方法，采用L-8800氨基酸自动分析仪进行测定，仪器进样时泵1的压力为2～15 MPa，流速0.4 mL/min；泵2的压力为0.5～2 MPa，流速0.35 mL/min。

1.3.4 荞麦酒中总多酚含量测定[25]

分别精确吸取质量浓度为0.1 mg/mL没食子酸标准溶液0、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL、1.50 mL，用蒸馏水定容至25 mL，在波长756 nm处测定吸光度值，以没食子酸溶液质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线。

准确吸取荞麦酒样品1 mL，其他条件同建立没食子酸标准曲线，按照标准曲线计算公式计算样品中总多酚含量。

1.3.5 荞麦酒中总黄酮含量测定

参照NYT1295—2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》，测定样品中总黄酮含量。

分别吸取芦丁标准溶液（0.05mg/mL）0.025mL、0.50mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 0.1 mol/L三氯化铝溶液、3 mL 1 mol/L乙酸钾溶液，用甲醇定容，摇匀，室温静置30 min。在波长420 nm处测定吸光度值，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

1.3.6 荞麦酒中有机酸含量测定

参照GB/T15038—2006《葡萄酒，果酒通用试验方法》[26]，测定荞麦酒中的部分有机酸含量，委托贵州省产品质量监督检验院（国家酒类及加工食品质量监控检验中心）完成。

2 结果与分析

2.1 荞麦酒中可溶性蛋白质含量

以蒸馏水为空白对照，绘制标准曲线，结果见图1。得到线性回归方程：Y=7.618 9x+0.017 9，相关系数R2=0.998 6。

图1 蛋白质标准曲线Fig.1 Standard curve of protein

通过图1标准曲线可知，在0～0.1 mg/mL范围内，牛血清蛋白溶液的质量浓度与吸光度值之间呈现较好的线性关系。在波长595 nm处分别测定3组处理酒样的吸光度值，结果表明，荞麦酒中可溶性蛋白质含量为1.23 mg/mL。

2.2 荞麦酒中游离氨基酸测定结果

2.2.1荞麦酒中游离氨基酸含量及种类

游离氨基酸是液态法发酵荞麦酒中重要的营养成分，游离氨基酸含量与荞麦酒的色、香、味、格都有一定关系。图2为荞麦酒中17种游离氨基酸的测定结果，由图2可知，荞麦酒中包括7种人体必需氨基酸（缬氨酸（Val）300 mg/L、亮氨酸（Leu）280 mg/L、异亮氨酸（Ile）190 mg/L、蛋氨酸（Met）70 mg/L、苯丙氨酸（Phe）250 mg/L、苏氨酸（Thr）340 mg/L、赖氨酸（Lys）570 mg/L），2种半必需氨基酸（组氨酸（His）220 mg/L、精氨酸（Arg）930 mg/L）以及8种非必需氨基酸。其中谷氨酸含量最高，占总氨基酸的23%，谷氨酸是人体内一种重要的营养成分，在治疗精神分裂症、神经衰弱以及肝病方面都具有良好的疗效。

图2 荞麦酒中游离氨基酸测定结果Fig.2 Determination results of free amino acids in buckwheat wine

2.2.2 荞麦酒与其他黄酒中游离氨基酸含量对比

荞麦酒与其他黄酒中游离氨基酸含量对比见表1。从表1可以看出，荞麦酒中游离氨基酸的含量明显高于三种市售黄酒产品，其中荞麦酒中必需氨基酸约占总氨基酸的24.8%，G-H中必需氨基酸约占总氨基酸的32.9%，J-H中必须氨基酸约占总氨基酸的21.5%，荞麦酒中的必需氨基酸所占总氨基酸比例介于G-H与J-H之间。荞麦酒中含量最高的是谷氨酸1 860 mg/L，G-H黄酒中含量最高的是脯氨酸471.4 mg/L，T-H黄酒中含量最高的是精氨酸425.5 mg/L，J-H中含量最高的是丙氨酸166.536 mg/L。

表1 荞麦酒与其他黄酒中游离氨基酸含量对比Table1 Comparison of free amino acids in buckwheat wine and other rice wines

续表

2.3荞麦酒中总多酚含量测定结果与分析

2.3.1 没食子酸标准曲线的建立

以蒸馏水空白组作为参比，以没食子酸质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到没食子酸标准曲线回归方程：Y=5.014x+0.013 4，相关系数R2=0.998 4。表明没食子酸标准品质量浓度与吸光度值之间呈现良好的线性关系。

2.3.2 荞麦酒中总多酚含量测定

按上述最优方法测定荞麦酒中总多酚，平行6次试验测定，结果见表2。从表2可以看出，测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.42%。荞麦酒中总多酚含量为0.321 2 mg/mL。荞麦酒中的多酚含量相对丰富且稳定，使得荞麦酒具有一定的抗氧化能力，多酚对动物和人体内的多种致病病毒的生长都能产生明显的抑制效果。对于人体软骨组织的保护与预防骨质疏松、保护眼睛视网膜、防止视力老化都有重要的作用，同时还具有抗菌、消炎等功效，因此荞麦酒具备良好的保健功能。

表2 荞麦酒多酚含量测定结果Table2 Determination results of polyphenol content in buckwheat wine

2.4 荞麦酒中总黄酮含量测定结果与分析

2.4.1 芦丁标准曲线的建立

以芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线为Y=27.301x+0.000 2，相关系数R2=0.999 9，在0～0.02 mg/mL范围内，芦丁质量浓度与吸光度值之间呈现较好的线性关系。在波长420 nm处分别测定3组处理酒样的吸光度值，结果表明，荞麦酒中总黄酮含量为0.122 6 mg/mL。

2.4.2 荞麦酒中总黄酮含量的测定

按上述最优方法测定荞麦酒中总黄酮，平行6次试验测定，结果见表3。从表3可以看出，测定结果的相对标准偏差为0.89%。荞麦酒中总黄酮含量为0.122 6 mg/mL，重现性良好，总黄酮含量稳定。

表3 荞麦酒总黄酮含量测定结果Table3 Determination results of total flavonoids in buckwheat wine

2.5 荞麦酒中主要有机酸测定结果与分析

荞麦酒的4种主要有机酸测定结果如表4所示，含量最高的是柠檬酸（1.62 g/L），其次是琥珀酸（0.65 g/L），同时还含有苹果酸以及草酸（0.11g/L），苹果酸具有抗疲劳、保护肝脏和增强心脏功能的功效。和传统工艺的黄酒相比，荞麦酒中草酸的含量和传统的黄酒相当，柠檬酸、草酸的含量相对丰富，而柠檬酸则具有延缓衰老，消除疲劳等功效，琥珀酸又是导致酒体回味的主要物质，因此在多种有机酸的共同作用下，形成荞麦酒独有的风味。

表4 荞麦酒中主要有机酸测定结果Fig.4 Determination results of main organic acids in buckwheat wine

3 结论

本文分析了荞麦酒酒体中可溶性蛋白质、游离氨基酸、有机酸、总多酚、总黄酮等营养物质，结果表明，发酵罐酿造荞麦酒其营养成分丰富，其中荞麦酒可溶性蛋白含量为1.23 mg/mL，游离氨基酸总量达8 080 mg/mL，明显高于市售酒G-H、T-H、K-H。总多酚含量为0.321 2 mg/mL；总黄酮含量为0.122 6 mg/mL；4种常见有机酸的含量分别为草酸0.11g/L、苹果酸0.11g/L、柠檬酸1.62g/L，琥珀酸0.65g/L。

发酵罐液态发酵荞麦酒使得水溶性营养因子更多的保留在酒中，使其具有更好的保健价值，开拓了荞麦资源的利用途径，同时为荞麦酒工业化生产提供理论依据。