两种酒曲制备米酒品质对比研究

母应春，姜 丽，苏 伟

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

米酒一直以营养物质含量高、保健养生而著称，作为我国传统的低度发酵酒，在制酒过程中微生物代谢不仅赋予其独特的风味和口感，还具有丰富的营养成分和特殊的食疗功效[1]。酒曲是在特定的生态环境中，用成曲作为种子培养制作而成，含有细菌和真菌在内的大量微生物，对米酒品质的形成起着决定性作用[2]，因而有“曲是酒之骨”之称。酒曲在米酒酿造过程中起糖化发酵的作用，酒曲中富集的微生物种类及产生的酶可直接影响发酵酒的品质[3]。因此，不同酒曲发酵的米酒品质会存在差异。

盘州彝族米酒采用特色的自制彝族酒曲酿制而成，酒曲中加入多种仅当地生产的中草药及其他材料混合制成，酒曲中微生物种类繁多。酒曲的微生物种类、数量和相互作用对于米酒的正常发酵非常重要，这决定了米酒的出酒率和风味品质[4]。HUANG Z R等[5]研究了武夷红曲糯米酒酿造过程中酒曲微生物与风味形成的关系，最后确定酒曲中的葡糖醋酸杆菌、乳酸杆菌，乳球菌3种细菌属和毕赤酵母、威克汉姆西弗酵母、酿酒酵母3种真菌属对风味贡献最大。仲桢玉等[6]研究了5种不同酒曲发酵葛根酒中的挥发性物质结果发现，不同酒曲发酵的葛根酒所产生的挥发性气味差异较大。目前关于彝族酒曲的报道尚且较少。本研究主要采用两种酒曲发酵米酒，检测发酵期间米酒基本品质的变化及成品米酒风味物质成分，为稳定米酒特有风味物质提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯净水：市售；糯米：贵阳市花溪区的优质糯米；酒曲1：贵州省盘州市淤泥河某酒厂提供；酒曲2：酒曲1与纯种根霉曲（Rhizopus oryzae）（贵州省轻工业科学研究所）按1∶1比例混合。

1.2 仪器与设备

DHP-420恒温培养箱：天津天泰仪器有限公司；FW100粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；SHZ-D循坏水式多用真空泵：巩义市科华仪器设备有限公司；酒精计：河北省武强县同辉仪表厂；HH-S6电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；pHS25pH酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司。

1.3方法

1.3.1 米酒的加工工艺流程及操作要点

（1）浸米：糯米需清洗2～3次，去除杂质后沥干水分，加水浸泡5 h左右，根据环境的温度可适当调整浸泡时间的长短，浸泡到米粒中心有明显的裂纹，用手指能轻易碾碎即可。

（2）蒸饭：把浸泡后的米沥干，放在蒸屉上大火蒸至米粒尚有白心后改小火蒸至米粒白心消失。

（3）冷却：糯米蒸煮结束后，取出待温度降到30～35℃左右。

（4）拌曲：按照实验设计分别加入3.2%的酒曲1和酒曲2，边加边搅拌，尽量使每一粒米上都附着酒曲。

（5）前发酵：用纱布分别将两组拌好酒曲的米粒放入30℃恒温培养箱中培养，待24 h左右，附着酒曲的米粒松散开并长了白毛即可用消毒灭菌好的发酵罐装罐，并按照熟米∶水（1∶2）的比例加入凉开水。盖好发酵膜，贴好组别标签。放入26℃恒温条件下持续发酵。

（6）后发酵：待发酵罐中的米粒漂浮在酒液表面上，一般是装罐后24 h左右，用保鲜膜密封发酵罐，使醪液密封发酵。

（7）检测：在装罐后发酵的第5、10、15、20、25、30天分别取出两组发酵酒样测定各项基础性指标，每个指标三组平行，并记录其数据。

1.3.2 酒曲液化能力的测定

酒曲液化力的测定方法参考傅金泉[7]的方法，液化力是指每克干曲在30℃温度条件下经过1 h液化淀粉的克数[g（/g·h）]。

1.3.3 酒曲糖化能力的测定

酒曲糖化力的测定参考傅金泉的检测方法，采用菲林试剂法[8]。

1.3.4 酒精度的测定

酒精度的检测采用GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中蒸馏法，米酒经过蒸馏以后，用酒精计来测定最终馏出液中酒精度[9]。

1.3.5 氨基酸态氮和总酸含量的测定

用酸碱中和法对氨基酸态氮和总酸含量进行测定，氨基酸是一种两性化合物，甲醛可与氨基酸分子上的氨基发生反应，反应后氨基失去碱性，而使羧基呈现酸性。可用氢氧化钠的溶液来滴定羧基，计算氨基酸态氮含量[10]。

1.3.6 总糖的测定

根据黄酒的国家标准利用亚铁氰化钾滴定法测定总糖的含量[10]。

1.3.7 可溶性固形物的测定

可溶固形物的测定方法按照折光计法进行测定[11]。

1.3.8 米酒风味物质的测定

通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术对两种米酒进行主要成分的检测[12]。本研究采集的数据由贵州省农产品质量检测检验中心进行，自动生成色谱峰后进行质谱库比对，所有比对将结果自动生成“峰表”。根据“峰表”中获得各主要风味物质的含量原始数据，进行数据的提取和数据的预处理，用气质联用仪对其进行分离和鉴定。

挥发性成分提取：根据尚柯等[13]采用的方法，量取5 mL酒样加入0.5mL乙酸丁酯内标溶液，充分混匀后用于GC-MS分析，且在同等条件下测定并建立标准曲线。

气相色谱条件：样品通过HP-FFAP色谱柱（50m×200μm，0.33 μm）进行分离；程序升温：50℃（1 min）；以6℃/min升温至80℃（2 min）；再以6℃/min升温至200℃（5 min）；再以20℃/min升温至220℃（5 min）；进样口温度250℃；载气：氦气（He）；流速：1.0 mL/min；样液进样量：1.0 μL。

质谱条件：离子源温度：250℃；电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量：70 eV；单离子监测（single ion monitoring，SIM）模式扫描。对采集得到的各峰经质谱计算机数据系统检索，核对Nist2005和Wiley275标准质谱图，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 不同酒曲酶活力比较结果

糖化、液化能力是衡量酒曲发酵能力的重要指标，两种酒曲的酶活力测定结果见表1。由表1可知，两种酒曲的糖化力、液化力的变化趋势均是酒曲2＞酒曲1，说明混合曲能够有效提高酶活力，因此，混合酒曲的效果更好。

表1 酒曲酶活力测定结果Table1 Determination results forJiuquenzyme activity

2.2 不同酒曲发酵米酒的pH比较

米酒pH随时间的变化趋势见图1。由图1可知，两种酒曲发酵的米酒在发酵过程中pH都是随着发酵的时间延长呈稳步上升的趋势，发酵20d后大致呈平稳趋势，pH分别为3.8和3.9左右。刚开始时各种微生物快速生长繁殖，因细菌的传代时间比酵母要短得多，所以快速生长繁殖酒产生乳酸和乳酸杆菌素，使得pH值较低。随着发酵时间的增长，酒精的积累和大分子物质的分解和弱碱性物质的大量增加，pH值开始升高。酒曲2发酵酒的pH在各阶段都比酒曲1发酵酒的pH高。两种酒的pH变化趋势与阎文飞等[14]对黄酒发酵过程中pH的变化趋势基本一致。

图1 不同酒曲对发酵米酒pH值的影响Fig.1 Effect of differentJiuquon pH value of fermented rice wine

2.3 不同酒曲发酵酒的总酸比较

不同酒曲发酵酒的总酸随时间的变化见图2，由图2可知，随着发酵时间的延长，两种酒的总酸含量都呈现上升趋势，酒曲1发酵酒的总酸含量最高达到4.52 g/L，酒曲2发酵酒的总酸含量最高达到3.58 g/L。从整个发酵过程来看酒曲1发酵酒的总酸含量均高于酒曲2发酵的酒。这可能与酒曲中微生物种类及发酵特性有关。

图2 不同酒曲对发酵米酒总酸含量的影响Fig.2 Effect of differentJiuquon total acid contents in fermented rice wine

2.4 不同酒曲发酵酒的氨基酸态氮比较

不同酒曲发酵酒的氨基酸态氮含量随时间的变化见图3。由图3可知，两种酒的氨基酸态氮含量在发酵过程中均呈上升趋势。酒曲1发酵酒的氨基酸态氮含量变化没有酒曲2发酵酒的稳定，酒曲2发酵酒的氨基酸含量总体呈现明显的上升趋势，到25 d时达到最大0.3 g/L。这可能是在发酵初期原料及酒曲中的蛋白质被酵母菌和霉菌等微生物代谢的多种蛋白酶快速的分解成低分子氨基酸、肽，促使酒液中氨基酸的含量快速增加[15]。结果表明酒曲2发酵的酒的品质和风味都要高于酒曲1发酵的酒。

图3 不同酒曲对发酵米酒的氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of differentJiuquon amino acid nitrogen contents in fermented rice wine

2.5 不同酒曲发酵米酒的可溶性固形物比较

不同酒曲发酵酒的可溶性固形物随时间的变化见图4。由图4可知，酒曲1发酵酒和酒曲2发酵酒的可溶性固形物含量均呈先下降后又缓慢上升的趋势，在15～20 d时最低，总体是酒曲2发酵酒中的可溶性固形物多于酒曲1发酵酒，可能是因为酒曲2是混合酒曲，微生物含量相对较多。

图4 不同酒曲对发酵米酒的可溶性固形物含量的影响Fig.4 Effects of differentJiuquon soluble solids contents in fermented rice wine

2.6 不同酒曲发酵米酒的酒精度比较

不同酒曲发酵酒的酒精度随时间的变化趋势见图5。由图5可知，两种酒曲酿造的米酒在发酵过程中，酒精度呈现上升趋势，在25 d时达到最高，分别为8%vol和10%vol，但酒曲2发酵的酒的酒精度明显高于酒曲1发酵的酒。原因是酒曲2是采用盘州酒曲与根霉曲按1∶1比例混合的，而盘州酒曲中含有较多根霉与酵母，糖化酶活力和液化酶活力较高，糖类物质在酵母的作用下更多的转化为乙醇，使米酒中的酒精度含量增高。

图5 不同酒曲对发酵米酒的酒精度的影响Fig.5 Effect of differentJiuquon the alcohol contents of fermented rice wine

2.7 不同酒曲发酵米酒的总糖比较

不同酒曲对发酵酒总糖含量的影响见图6。由图6可知，整个发酵过程中酒曲2发酵米酒的总糖含量高于曲1发酵的米酒，因为酒曲2的糖化力高，微生物分解淀粉为糖的能力强，提高了酒液的总糖含量。酒液中的总糖含量随着发酵时间的延长，呈现递减且趋于平稳，主要是由于酒曲中的多种霉菌在大量繁殖生长，产生的多种酶将原料淀粉中的糖苷键快速的水解，转化为葡萄糖等多种单糖、低聚糖，使得总糖含量降低[16]。

图6 不同酒曲对发酵米酒的总糖含量影响Fig.6 Effect of differentJiuquon the total sugar contents in fermented rice wine

2.8 不同酒曲发酵米酒的风味物质比较分析

发酵酒中风味成分非常丰富复杂，主要的成分有酸、酯、醇、氨基酸、挥发性酚、烯、脂肪酸、醛和酮等，其化学特性有一定的差异，在米酒中的含量也不尽相同。这些物质有着自身独特的气味，在经过互相协同累加、抑制分离等作用，使米酒拥有自成一格的风味，呈现出与众不同的酒香[17-18]。使用GC-MS技术对两种酒曲发酵30d的米酒进行主要风味成分的检测，两种酒曲主要风味成分的GC-MS色谱图见图7，其种类及相对含量分别见表2和表3。

图7 酒曲1（A）和酒曲2（B）发酵米酒主要风味成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.7 Total ion chromatogram of the main flavor components in rice wine fermented byJiuqu1(A)andJiuqu2(B)analysis by GC-MS

表2 酒曲1发酵米酒主要风味成分种类及相对含量Table2 Types and relative contents of main flavor components in rice wine fermented byJiuqu1

表3 酒曲2发酵米酒主要风味成分种类及相对含量Table3 Types and relative contents of main flavor components in rice wine fermented byJiuqu2

由表2可知，使用GC-MS技术检测到酒曲1发酵米酒中共有24种物质，主要为醇类、酯类、酸类和醛类物质。其中醇类5种；酯类6种；酸类10种；醛类3种。由表3可知，酒曲2发酵酒中共检测出23种成分。其中醇类5种、酯类5种、酸类10种、醛类3种。两种酒曲发酵米酒中主要风味成分组成种类上基本相同，检测出的挥发性化合物质都是酸类物质的种类及含量最多。

两种发酵米酒中含量最高的醇类物质都是甲醇，正乙醇和β-苯乙醇，其中酒曲1发酵米酒中甲醇、正乙醇、β-苯乙醇含量分别为1.32%，1.51%，0.54%；酒曲2发酵米酒中含量为1.73%，1.65%，0.86%。可知使用酒曲2发酵米酒中的甲醇，正乙醇和β-苯乙醇含量都大于酒曲1发酵米酒。β-苯乙醇具有蜜香玫瑰味的清雅香气，落口有绵甜清爽之感[19]，是米酒标准中质量指标之一，其在酒中的含量直接影响酒的品质。由此可知酒曲2发酵米酒的品质要高于酒曲1发酵米酒。

酯类是具有芳香的化合物，是形成酒体香气浓郁的主要因素，其中乳酸乙酯和乙酸乙酯以及己酸乙酯是酒的重要香味成分，能够产生果香，花香，脂肪香和奶油香[20-22]，如乙酸乙酯有果味和甜味[23]。两种酒中酯类物质含量最高的是戊酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯。其中酒曲1发酵米酒中戊酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯含量分别为1.14%，0.95%，1.01%；酒曲2发酵米酒中含量为4.06%，0.78%，0.76%。酒曲2发酵米酒中戊酸乙酯的含量明显大于酒曲1发酵米酒中戊酸乙酯的含量。酒曲1中乳酸乙酯的含量高于酒曲2，有研究报道，乳酸乙酯香弱味甜，适量使酒体有浓厚感，多则带苦味[23]。其中酒曲1中比酒曲2发酵米酒多一种辛酸乙酯化合物，微量的辛酸乙酯在浓香型白酒中具有比较明显的水果香；适量的辛酸乙酯含量对酒体复合香有较好的促进作用，但过多的含量会对酒体中其他香味成分表现出抑制作用[24]。

两种酒中含量最高的酸类物质都是丙酸和乙酸，其中酒曲1发酵米酒中丙酸和乙酸含量分别为41.85%，31.49%；酒曲2发酵米酒中含量为65.86%，酒曲1中为17.68%。酒曲2发酵米酒中丙酸含量为65.86%大于酒曲1，丙酸刺激性强，不易代谢；而酒曲1发酵米酒乙酸的含量为31.84%高于酒曲2，乙酸具有醋酸气味，爽口带甜，闻之有刺激性酸味，两者都会对酒的感官品质会造成负面影响[25]。

白酒中醛类物质是构成酒香不可缺少的重要成份之一。醛类的香味最为强烈，与醛相对应的酸、醇和酯的香味仅有醛的数十分之一到数百分之一[26]。两种酒中主要醛类物质是糠醛和乙醛，酒曲1发酵米酒中糠醛和乙醛的含量分别为9.99%、6.90%，酒曲2含量分别为3.46%、0.66%。两种酒曲发酵米酒中明显酒曲1发酵米酒中的糠醛和乙醛含量高于酒曲2。乙醛和糠醛是酱香、浓香等白酒中香味成份的骨干，尤其在酱香型白酒的呋喃类组份中，糠醛的含量最高，并且远远高于其他香型白酒。因此，糠醛已成为酱香型白酒的一个标志组份，是区别于其他香型白酒的主要特征[27]。乙醛是糖代谢的中间产物，有酸味，对米酒的风味也有重要影响。

3 结论

通过研究发现酒曲2的糖化酶、液化酶能力均高于酒曲1；发酵过程中酒曲2发酵米酒的pH、可溶性固形物、酒精度以及总糖含量整体上都均高于酒曲1发酵米酒，但发酵过程中酒曲1发酵米酒的总酸和氨基酸态氮含量整体上要高于酒曲2发酵米酒。采用顶空固相微萃取结合气质联用分析方法对两种不同酒曲发酵米酒中挥发性物质进行检测，鉴定出酒曲1发酵米酒中共有24种物质；酒曲2发酵米酒中共检测出23种成分，主要为醇类、酯类、酸类和醛类。两种酒曲发酵酒主要风味成分组成种类基本相同，差异主要表现在成分相对含量上。酒曲1发酵米酒主要挥发性物质有丙酸（41.85%）、乙酸（31.48%）、糠醛（9.99%）、乙醛（6.90%），酒曲2发酵米酒主要挥发性物质有丙酸（65.86%）、乙酸（17.68%）、戊酸乙酯（4.06%）、乙醛（3.46%）。