巨大芽孢杆菌L2粗提物的抑菌效果及其抑菌成分分析

吉玉玉，代园凤，陈 雪，李 祝*，肖 洋，杨 龙，张 素，赵妗颐，张钦语

（1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省烟草公司毕节市公司，贵州 毕节 551700；3.贵州省产品质量监督检测院，贵州 贵阳 550016）

芽孢杆菌（Bacillussp.）是生物防治中常用的拮抗菌[1]，具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点，其产生的代谢产物对植物、食品病原微生物防治有重要作用。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）作为广谱拮抗菌株针对不同植物及食品细菌病害均具有防治作用[2]，研究报道巨大芽孢杆菌可防治水稻纹枯病[3]、番茄灰霉病[4]、香蕉灰斑病[5]、甘薯黑斑病[5]、棉花立枯病菌[6]、根瘤镰刀病菌[6]、番茄青枯病菌[7]等。

巨大芽孢杆菌（B.megaterium）L2作为一种植物根系促生细菌[8]，由贵州大学生命科学学院真菌资源研究室分离得到，经前期课题组研究，拮抗菌L2粗代谢物浓度在1.5%～20%时能有效地抑制烟草赤星病菌菌丝生长，平皿培养7 d抑制率在25.3%～74.8%；对病原菌孢子萌发的抑制率随菌株L2粗代谢物浓度的增高而增高，在10%～50%时培养24 h抑制率为11.4%～87.7%；L2粗代谢物稀释1～80倍时，对烟草赤星病菌产孢的抑制率在78.2%～18.4%，浓度越高，抑制能力越强[9]，说明拮抗菌L2可能产生某些活性物质来抑制病原菌的生长，进而控制植物病害的发展。课题组对其生防机制也进行了初步探究，发现经含菌量为1.5×1010CFU/mL的L2发酵液处理后，离体烟草叶中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性均明显提高，其中PAL酶活性提高最大，达到对照的两倍多，而PAL、PPO、POD酶活的提高能有效促进植物防御病害的能力[10-11]。

引起番茄青枯病的病菌青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是最具侵染力和破坏力的植物病原细菌之一，菌系非常复杂，寄主范围相当广泛[12]，不仅可以危害番茄、茄子、辣椒等蔬菜，还可危害花生、香蕉等作物以及一些观赏植物和草，能导致全球50多个科200种植物感病[13]；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）引起的果树根癌病是一种世界范围的细菌性病害，该病菌可危害93个科，331个属，643个不同种的植物[14]；胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）所引起的魔芋软腐病是一种对魔芋种植业造成毁灭性打击的细菌性病害，是现在魔芋产业发展的主要威胁[15]。

本研究将对巨大芽孢杆菌L2抑菌活性成分进行提取分离，并以青枯雷尔氏菌为指示菌对分离的各组分进行活性追踪，并对分离到的粗提物组分进行青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌及欧文氏菌抑菌活性测定和气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）成分分析，以期为探索巨大芽孢杆菌L2菌体中的活性物质奠定基础，从中开发出防治番茄青枯病、魔芋软腐病以及果蔬根癌病等果蔬植物病害的高效抑菌剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）L2：由贵州大学真菌资源研究所分离，现保藏于中国典型培养物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC），保藏号：CCTCCNO.M2012381。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）T-37：中国农业科学院土壤肥料研究所。青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）RS-2、胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）EC-1：贵州大学微生物所分离、鉴定并保存。

1.1.2 试剂

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏（均为生化试剂）：上海盛思生化科技有限公司；氯化钠、石油醚（沸程60～90℃）、乙酸乙酯、氯仿、甲醇（均为分析纯）：重庆川东化工集团公司；柱层析硅胶、硅胶H、柱层析硅胶G、薄层色谱板：青岛海洋化工厂；氘代氯仿（分析纯）：武汉中科院波谱公司；Sephadex LH-20：瑞典AB公司。

5%浓硫酸乙醇溶液：量取5.1mL98%浓硫酸缓慢多次沿壁加入94.9 mL无水乙醇中，玻璃棒匀速搅拌。

0.8 %磷钼酸乙醇溶液：称取0.8 g磷钼酸与84.2 mL无水乙醇混合溶解，量取15mL98%浓硫酸缓慢多次沿壁加无水乙醇中，玻璃棒匀速搅拌稀释散热。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂15～20 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。121℃高温灭菌20 min。

营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。121℃高温灭菌20 min。

营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：NB培养基中加入琼脂15～20 g/L。

1.2 仪器与设备

FA2204N电子天平：上海菁海仪器有限公司；SHP-250智能生化培养箱：上海光都仪器设备有限公司；BIOMATE 3S紫外分光光度计：美国Thermo Fisher公司；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；SFY10-100液体发酵罐：江大科技有限责任公司；WFH-203B三用紫外分析仪：上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巨大芽孢杆菌L2菌粉的制备

按照巨大芽孢杆菌L2最佳发酵条件[11]进行发酵，将种子液按照6%（V/V）接种量转接到装液量为80 L/400 L的发酵罐中，搅拌速度150 r/min，通气量1.5 L/min，在30℃条件下培养48 h终止发酵，高速离心取沉淀，60℃条件下减压浓缩干燥3 h，粉碎成菌粉（过60目筛）备用。

1.3.2 粗提物浸膏的制备

利用乙醇回流提取法[16]得粗提物浸膏：取巨大芽孢杆菌L2菌粉5 000 g和95%乙醇15 L于回流装置中加热4 h，温度为60～100℃，重复3次得菌株L2粗提取液，在旋转蒸发仪上减压浓缩至黏稠状时加少量水溶解（浸膏不再呈黏稠状即可），加入乙酸乙酯1∶1（V/V）萃取得上层乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩后得到粗提物浸膏（192.3 g）。

1.3.3 粗提物的分离纯化

利用硅胶柱层析法[17]分离菌株L2粗提物：取浸膏加乙酸乙酯溶解1∶1（V/V），以1∶1.2（V/V）比例吸附于40～80目硅胶中，水浴挥干乙酸乙酯，不断搅拌，直至硅胶复为干燥粉末状，然后在硅胶层析柱上干法上样，以石油醚、石油醚：乙酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1（V/V））、乙酸乙酯:甲醇（30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1（V/V））、甲醇梯度洗脱，进行柱层层析分离。以10 L为一个冲柱体系洗脱，分段收集洗脱液，硅胶薄层板以对应洗脱剂为展开剂跟踪鉴定，合并相同组分得洗脱组分LE1～LE17，以青枯雷尔氏病菌为指示菌对各组分粗提物进行抑菌活性追踪，以明确其抑菌活性组分的分布。

1.3.4 抑菌活性的测定

根据刘芳等[18]的方法，分别在1 mL的液体培养基中加入10 μL用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制的质量浓度为100 mg/mL的各组分粗提物、等体积的DMSO及用无菌水配制的质量浓度为100 mg/mL的氯霉素（药物对照），在10%接种量的基础上接入3种植物病原菌（T-37、RS-2和EC-1），设3个平行，在37℃、120 r/min的条件下进行摇床培养，根据文献[18]确定最佳培养时长与最适波长，培养最佳时间后取出稀释4倍在最适波长条件下测定其光密度（OD）值，抑菌率按下式计算：

式中：OD对照为菌株L2菌悬液OD值；OD处理为粗提物处理组的OD值。

1.3.5 粗提物洗脱组分的抑菌效果及其成分分析

粗提物洗脱组分对三种植物病原菌进行抑菌试验，并计算活性粗提物洗脱组分对3种植物病原菌的半抑制浓度（50 inhibiting concentration，IC50）值；采用GC-MS分析菌株L2粗提物柱层析洗脱组分的化学成分。

气相色谱条件：色谱柱为AB-INOWAX毛细管柱（30m×0.25 μm×0.25 mm），载气为高纯氦气（He）（99.999%），载气流量1.0 mL/min；汽化室温度250℃；毛细管程序升温，初始温度50℃（保持2 min），以5℃/min升温至240℃后，保持15 min，运行时间55 min；柱前压7.65 psi，不分流，溶剂延迟时间：5.0 min；进样量1 μL。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV；电子倍增器电压1 624 V；离子源温度230℃；GC-MS接口温度280℃；四极杆温度150℃；发射电流34.6μA；质量范围29～500 amu。

1.3.6 数据统计

应用Excel进行数据整理，IBM SPSS Statistics 22进行Probit Regression分析，所得结果用IC50±标准差（standard deviation，SD）表示，并利用IBM SPSS Statistics 22进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 粗提物的分离与抑菌活性追踪

2.1.1 粗提物洗脱组分抑菌活性追踪

以乙醇回流提取法与硅胶柱层析法对巨大芽孢杆菌L2活性粗提物浸膏进行提取、分离纯化，通过薄层层析（thin layer chromatography，TLC），5%浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液110℃加热显色至出现颜色清晰的斑点，初步分离合并获得17段样品，分别为LE1～LE17。洗脱组分活性追踪结果如图1所示，洗脱组分LE4、LE5、LE6、LE7、LE11、LE12在1 mg/mL质量浓度下抑菌率均在50%以上，对病原菌青枯雷尔氏菌RS-2均有较强的抑制作用，其中洗脱组分LE4与LE7的抑菌率最高，分别为79.54%、82.61%。因LE7组分中活性成分经TLC层析色谱分析比洗脱组分LE4复杂，不易进行下一步分离，而洗脱组分LE4组分极性适中，成点性好，因此考虑到实际操作原因，选择洗脱组分LE4组分继续进行硅胶柱层析分离。

图1 菌株L2洗脱组分LE1-LE17对青枯雷尔氏菌RS-2抑菌率的影响Fig.1 Effect of eluant components LE1-LE17 of strain L2 on antibacterial rate ofRalstonia solanacearumRS-2

2.1.2 粗提物洗脱组分LE4抑菌活性追踪

依据活性追踪对洗脱组分LE4进行硅胶柱层析分离，分析在波长254 nm紫外条件下观察薄层层析情况及5%浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液110℃加热显色情况，合并相同的主点获得7段样品，分别为组分LE4-1～LE4-7。7段样品抑菌活性追踪结果如图2所示，组分LE4-1、LE4-2、LE4-6、LE4-7在质量浓度1 mg/mL条件下对病原菌RS-2未有明显抑制作用，组分LE4-3、LE4-5在此浓度下对RS-2有较强的抑制作用，其中组分LE4-5的抑菌率最高，达到了80.84%，表明菌株L2菌体细胞中的抑菌活性物质主要在粗提物组分LE4-5中。

图2 菌株L2洗脱组分LE4对青枯雷尔氏菌RS-2抑菌率的影响Fig.2 Effect of eluant components LE4 of strain L2 on antibacterial rate ofRalstonia solanacearumRS-2

2.2 LE4-5抑菌效果及其成分分析

2.2.1 LE4-5抑菌率测定

选用3种植物病原菌（RS-2、T-37、EC-1）利用测OD值法对洗脱组分LE4-5进行抑菌率测定，观察其抗菌效果，LE4-5对3种植物病原菌的抑菌试验结果见图3。由图3可知，粗提物洗脱组分LE4-5在质量浓度1.2 mg/mL条件下对3种植物病原菌的抑制作用不尽相同，对胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1有轻微抑制，抑菌率为20.83%；对根癌农杆菌T-37具有较好的抑菌作用，在质量浓度1.4 mg/mL下抑菌率达到最高，为59.58%，IC50值为（1.215±0.078）mg/mL；对青枯雷尔氏菌RS-2抑菌率最高，达到91.04%，IC50值为（0.512±0.056）mg/mL，具有较强的抑制作用。粗提物洗脱组分LE4-5能够有效抑制RS-2病菌和T-37病菌的生长，并随其质量浓度的增加，抑菌效果显著增加（P＜0.05），可见粗提物洗脱组分LE4-5对番茄青枯病菌与果树根癌病菌具有较好的拮抗效果，尤其是对番茄青枯病具有较强的抑制作用。

图3 洗脱组分LE4-5对菌株RS-2、T-37、EC-1抑菌率的影响Fig.3 Effect of eluant components LE4-5 on antibacterial rate of strains RS-2,T-37 and EC-1

2.2.2 洗脱组分GC-MS成分分析

粗提物洗脱组分LE4-5的化学组成GC-MS测定的总离子流图见图4。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图，确定了LE4-5的化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量，结果见表1。由表1可知，洗脱组分LE4-5中共检测到27种脂肪酸成分，主要含有亚油酸（linoleic acid）、亚油酸甲酯（methyllinoleate）、十五烷酸（pentadecanoicacid）、油酸（oleicacid）等，其中，不饱和脂肪酸相对含量达70.686%，以亚油酸（23.607%）、亚油酸甲酯（14.444%）、油酸（4.337%）为主；饱和脂肪酸相对含量为19.274%，以十五烷酸（5.182%）、12-甲基十四烷酸（5.099%）、软脂酸（5.011%）为主。

图4 洗脱组分LE4-5化学成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.4 Total ions chromatogram of chemical constitution of eluant components LE4-5 analysis by GC-MS

表1 洗脱组分LE4-5化学成分GC-MS分析结果Table1 Results of chemical constitution of eluant components LE4-5 analysis by GC-MS

2.3 讨论

脂肪酸及其衍生物是天然、高效食品抑菌剂的重要来源[19]，其中大部分被美国食品及药品管理局（food and drug administration，FDA）认证为一般公认安全（generally recognized as safe，GRAS），可作为食品添加剂允许直接添加到食品中[20-21]。以脂肪酸为主体可以衍生出种类繁多的脂肪酸衍生物，主要包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸糖酯、脂肪醇、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸盐等[22]。近年来，脂肪酸及其衍生物的抑菌作用受到了人们的广泛关注。已有研究表明，脂肪酸及其衍生物可抑制丝状真菌以及酵母菌的生长，比如面包中易染的桧状青霉、产黄青霉、红曲霉以及常见的黑曲霉、娄地青霉、詹森青霉、白色念珠菌、酿酒酵母等[23-25]。SUN C Q等[26]比较了脂肪酸及其甘油单酯对幽门螺旋杆菌（慢性胃炎及胃溃疡的致病菌）的抑菌效果，发现月桂酸是最有效的饱和脂肪酸，油酸和亚麻酸是最有效的不饱和脂肪酸；张希等[27]研究发现，在以大肠杆菌与白色念珠菌为指示菌时，油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸的抑菌活性分别高于碳链长度相同的硬脂酸、花生酸等饱和脂肪酸，脂肪酸甲酯、乙酯对供试菌抑制效果较差，但同碳链长度的脂肪酸乙酯抑菌活性强于甲酯；KELSEY J A等[28]研究了各种脂肪酸及其甘油单酯对金黄色葡萄球菌（肉制品中致病菌）的抑制效果，结果表明肉豆蔻酸、棕榈酸、亚油酸的甘油单酯对金葡球菌有一定的抑制作用；WAITERS D等[29]研究发现，亚油酸能有效地抑制终极腐霉菌、立枯丝核菌、燕麦叶炫菌、可可丛枝病菌（植物病害菌）的生长。

3 结论

本试验通过对巨大芽孢杆菌L2菌体乙酸乙酯部位的化学成分进行初步提取、分离，结合活性追踪、抑菌率测定和GC-MS分析，探究了具有较强抑菌活性的粗提物洗脱成分LE4-5中的化学成分。活性粗提物LE4-5对胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1、根癌农杆菌T-37、青枯雷尔氏菌RS-2的抑菌率分别为23.83%、59.58%、91.04%，对RS-2病菌和T-37病菌的IC50值分别为（0.512±0.056）mg/mL和（1.215±0.078）mg/mL。GC-MS分析其主要成分为亚油酸、亚油酸甲酯、油酸等，其中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸分别达到总脂肪酸的70.686%和19.274%，以不饱和脂肪酸为主。菌株L2粗提物LE4-5对两种食品植物病原菌株RS-2和T-37均有较好的抑菌效果，可推测不饱和脂肪酸类成分与其抑菌有效性密切相关，可能是其主要的药效物质基础。