甜高粱青贮饲料中乳酸菌最佳添加剂量的探讨

李荞荞，王曙阳*，董妙音，许富强，陈积红，3，胡 伟，刘 敬，李文建，3

（1.中国科学院 近代物理研究所，甘肃 兰州 730000；2.中国科学院大学 生命科学学院，北京 100049；3.甘肃省辐照诱变育种工程实验室，甘肃 武威 733001）

甜高粱作为饲用及糖料作物被长期栽种，营养丰富、生物产量高、用途广泛、对生长的环境条件不严格，是解决降低国际畜牧养殖成本的最佳饲料，也是缓解国际能源紧张的生物质能[1]。青贮是保存和开发饲料资源、发展“节粮型”畜牧业的有效手段[2]。青贮后的甜高粱酸甜适宜，牲畜喜欢采食，饲喂奶牛后产奶量增加[3]。添加乳酸菌能增加青贮早期乳酸菌的数量，迅速降低pH，从而抑制霉菌和其他细菌的生长繁殖，改善青贮发酵品质[4]。添加同型乳酸菌可以快速增加乳酸含量，减少蛋白降解和氨基酸态氮的含量[5]，但同型菌发酵产生的有机酸不足以抑制真菌的繁殖，青贮料开封后，易引起二次发酵，导致有氧腐败，而异型乳酸菌发酵能够产生乙酸，乙酸可以抑制真菌，提高青贮饲料的有氧稳定性，结合二者的优势，添加同型菌和异型菌组成的复合菌剂，可以获得最优品质的青贮饲料[6]。发酵品质的评价主要是考察青贮饲料感官情况、营养成分及发酵品质[7-8]。

目前，饲用型甜高粱在国内外大面积推广种植，市场上青贮菌剂的种类也日益增多，但国内甜高粱青贮产业化研究和与开发仍处在起始阶段，针对甜高粱特性而开发出的青贮菌剂较少，李俊等[9]研究发现，甜高粱青贮成本高于玉米青贮，但饲喂效果优于玉米青贮，董妙音等[2]研究发现，接种自制复合青贮菌剂FHI可提高甜高粱青贮品质。因此，筛选研发适合甜高粱品种的添加剂，并优化出最佳添加量，降低甜高梁青贮成本，对提高甜高粱青贮品质及青贮产业化研究有重要意义。目前对于复合乳酸菌制剂对甜高粱青贮最佳添加量的优化试验鲜有报道，本研究通过测定分析5组不同添加剂量的自制复合乳酸菌剂以及美国、台湾商品青贮菌剂对甜高梁秸秆青贮后的感官评价，营养成分以及发酵品质，综合评价青贮质量，以探讨自制复合乳酸菌剂对甜高梁秸秆青贮的最佳添加量，为自制的青贮菌剂的推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青贮原料：甜高梁秸秆，种植于甘肃省武威市近代物理研究所产业园，收割于2017年10月份。

菌剂：试验所用的乳酸菌复合菌剂由中国科学院近代物理研究所微生物室制备，由Lact1、Lact2、Lact3、Lact4四种乳酸菌按1∶7∶1∶1的比例混合而成，其中Lact1、Lact2、Lact3、Lac4菌株分别为干酪乳杆菌、玉米乳杆菌、布氏乳杆菌、布氏乳杆菌，Lact1、Lact3是从甜高梁秸秆中分离，Lact2、Lac4是从玉米秸秆中分离，均是经重离子辐照诱变筛选所得到的高产菌株。自制乳酸菌复合菌剂活性乳酸菌含量≥10亿个/mL；美国青贮菌剂、台湾青贮菌剂（由多种乳酸菌及酶组成，活性乳酸菌含量≥100亿个/g）：台湾亚芯生物科技有限公司。

葡萄糖：天津市大茂化学试剂厂；牛肉膏：北京双旋微生物培养基有限公司；蛋白胨：北京双旋微生物培养基有限公司；酵母提取物：天津市光复精细化工厂；柠檬酸钠：天津市北辰方正试剂厂；磷酸氢二钾：天津市恒兴化学试剂有限公司；乙酸钠：天津市巴斯夫化工有限公司；吐温-80：上海大众制药厂；硫酸镁：天津市北辰方正试剂厂；硫酸锰：北京双环化学试剂厂；以上试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

PB-10酸度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；SP-756PC紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；2675高效液相色谱仪：WATERS公司；DHP-9082电热恒温培养箱、DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；5417R高速台式冷冻离心机：德国Kendro公司；06粗纤维测定仪：济南仪器盛泰有限公司；DL-1万用电炉：北京科伟永兴仪器有限公司；ATN-100凯氏定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验方法

甜高粱秸秆人工剪碎至2 cm左右，控制青贮原料含水量为65%～75%，试验设8组，自制乳酸菌复合菌剂添加量0.5mL/kg组、1.0mL/kg组、1.5mL/kg组、2.0mL/kg组、2.5mL/kg组、美国组、台湾组以及空白对照组（CK），自制复合菌剂按不同的添加剂量分别稀释至20 mL，添加至100 g秸秆中，充分混合均匀后，装填至聚乙烯真空包装袋中，压实，封口，空白对照组（CK处理）中喷等量的蒸馏水；美国（1加仑/100t）、台湾商品菌剂组（20g/t）均按照商品的使用说明加至秸秆中，美国、台湾接种量分别为0.03785mL/kg、0.02g/kg。每个处理设置3个重复，共24袋，32℃青贮发酵17 d后，开袋取样检测，对饲料进行分析评价，比较各组的青贮效果，以选出自制乳酸菌复合菌剂对甜高粱青贮的最佳添加量。

1.3.2 测定方法

（1）感官评价

根据农业部颁布的《青贮饲料质量评定标准（试行）》进行感官评价，分别从pH值、水分、气味、色泽、质地等几个方面进行评价，分为优、良、中、下四个等级[10]。评价得分标准如表1所示。

表1 青贮饲料品质评价标准Table1 Quality evaluation standards of silage

（2）pH值的测定

开袋取青贮鲜样10 g于三角瓶中，加入90 mL蒸馏水，4℃冰箱静置24h，依次用4层纱布和中性定性滤纸过滤，制得浸提液，采用精密pH计测定浸提液pH值[11]。

（3）主要微生物类群数量分析

微生物数量采用平板记数法测定。取青贮鲜样10g，加90mL灭菌生理盐水，混合均匀后逐级稀释至10-7，悬浮液平板涂布，测定乳酸菌、酵母菌及霉菌数量。乳酸菌采用MRS培养基，37℃厌氧培养48 h后计数，酵母菌和霉菌采用孟加拉红培养基，28℃培养3～5 d后计数[12]。

（4）青贮后营养成分测定

干物质（dry matter，DM）含量的测定采用烘干法[13]；粗纤维、酸性洗涤纤维（aciddetergentfiber，ADF）和中性洗涤纤维（neutraldetergentfiber，NDF）的含量采用范氏（VanSoest）纤维测定法[14]；粗蛋白（crude protein，CP）和总氮含量GB 6432—1994《饲料中粗蛋白测定方法》中的凯氏定氮法测定[15]；总糖采用GB 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》中的斐林试剂热滴定法测定[16]；采用高效液相色谱仪测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量[17]。

（5）青贮品质评定方法

农业行业标准《青贮饲料质量评定标准》中，以氨基酸态氮、有机酸进行综合评定[8（]评定标准见表2～表3）。

表2 青贮饲料中氨基酸态氮与总氮比值评分标准Table2 Evaluation standards for amino acid nitrogen to total nitrogen ratio in silage

表3 青贮饲料中有机酸含量评分标准Table3 Evaluation standards for organic acid content in silage

此评分标准中，将pH值评分、有机酸评分和氨基酸态氮的评分相结合，pH值占25%，有机酸占50%，氨基酸态氮占25%，按比例相加得综合得分[8]。综合得分与青贮饲料质量等级关系如表4所示。

表4 青贮饲料综合得分与对应的质量等级Table4 Comprehensive score of silage and corresponding quality grade

1.3.3 数据处理

试验结果采用平均值±标准差表示，每组实验均做3个平行，采用Excel 2010进行数据统计，SPSS20.0进行数据分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加不同乳酸菌剂青贮后对青贮料感官评价的影响

青贮后，对不同乳酸菌添加剂处理的饲料进行感官评价，包括水分、pH值、干物质、气味、色泽、质地，结果如表5所示。

表5 不同乳酸菌添加剂处理的青贮饲料感官评价结果Table5 Sensory evaluation results of silage with different lactic acid bacteria additive

由表5可知，青贮发酵完成后，除美国组之外，青贮料的感官评价均优于对照组。自制复合乳酸菌剂按不同的剂量添加于甜高梁中青贮后，感官评价均为优等。复合菌剂各组pH较CK组均有降低，0.5 mL/kg组、2 mL/kg组以及1.5 mL/kg组pH较CK组显著降低（P＜0.05），pH值分别比对照低了0.27、0.27、0.25；各组气味均为不同程度的甘酸香味，无腐败霉味，除CK组外，其他各组青贮料为黄色，说明发酵良好。虽然感官评价能够对青贮饲料品质进行快速直观的判断，但感官评价存在主观性。因此，对青贮饲料的营养成分和发酵品质进行了进一步的分析。

2.2 不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮饲料微生物组成的影响

青贮发酵后，通过平板计数对饲料中微生物组成进行检测，结果如表6所示。

表6 不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮微生物组成的影响Table6 Effects of different lactic acid bacteria additive on microbial composition of sweet sorghum silage

青贮饲料中的乳酸菌数量越多，说明青贮饲料品质越好，而青贮饲料中的酵母菌、霉菌数量越多，说明青贮饲料的品质越差，并会引起青贮饲料的二次发酵[18]。由表6可知，乳酸菌添加剂可以影响甜高梁青贮饲料的微生物组成。青贮发酵后，乳酸菌数量均高于CK，以添加量1.5 mL/kg的处理最高，乳酸菌数量达到5×1010个/mL，显著高于CK处理（P＜0.05）；除CK组外，其他组均未检测到霉菌的存在，说明发酵品质良好；自制复合乳酸菌剂各添加量组均未检测出酵母菌的存在，可能是由于自制混合乳酸菌剂中所存在的异型乳酸菌，发酵除产生乳酸外，还产生乙酸，抑制酵母菌和霉菌，从而提高青贮物的有氧稳定性。说明添加自制乳酸菌混合菌剂，有效抑制了酵母菌和霉菌的生长，可以改善青贮饲料的发酵品质。

2.3 不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮饲料营养成分的影响

青贮完成后取样，测定甜高梁饲料的纤维、粗蛋白、总糖等指标，分析不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮饲料营养成分的影响，结果如表7所示。

由表7可知，甜高梁秸秆青贮完成后，干物质含量较CK均存在显著性差异（P＜0.05）。从粗蛋白含量来看，美国、台湾、0.5 mL/kg组、1.0 mL/kg组、1.5 mL/kg组粗蛋白含量较CK组有显著性差异（P＜0.05），1.5 mL/kg组处理的粗蛋白含量最高，较对照高出25.61%，较美国组、台湾组提高了13.51%、8.91%；美国、台湾、0.5 mL/kg组、1 mL/kg组分别较对照高出10.65%、15.33%、16.82%、24.30%。

表7 不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮营养成分的影响Table7 Effects of different lactic acid bacteria additive on nutritional components of sweet sorghum silage

饲料中的中性和酸性洗涤纤维含量高会影响动物的采食率和瘤胃消化率[19]。从酸性洗涤纤维含量来看，青贮后其含量较对照均有不同程度的降低，除2.5mL/kg组外，其他各组酸性洗涤纤维含量较对照均有显著性差异（P＜0.05），1.5 mL/kg组含量最低，为37.09%，比对照降低了38.05%，较美国组、台湾组分别降低了14.30%、26.09%；1 mL/kg组较对照降低了36.28%；美国、台湾、2.0 mL/kg组分别比对照降低了27.69%、16.19%、29.33%。从中性洗涤纤维含量来看，各实验组与对照相比均存在显著性差异（P＜0.05），其中，美国组中性纤维含量最低，为71.37%，较对照低了10.60%；其他各组之间相差不大，1.5 mL/kg组、1.0 mL/kg组分别较对照低了7.28%、8.13%，2.5 mL/kg组、2.0 mL/kg组分别较对照低了5.60%、6.04%。

总糖是影响饲料青贮效果的一个重要因素，因此在适宜的条件下，总糖含量越高，发酵过程中乳酸菌活动更活跃[13]。从各处理组的总糖含量来看，在添加青贮菌剂青贮后，总糖含量的下降速率减缓，使得青贮饲料中的养分得以有效保存，从而提高了饲料的青贮品质。添加量为1.5mL/kg组和0.5 mL/kg组的总糖含量显著高于对照组（P＜0.05），分别较对照高出18.18%、17.57%；1.5 mL/kg组总糖较美国组、台湾组分别高出14.01%、6.81%。

2.4 不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮饲料发酵品质的影响

通过测定青贮后各组有机酸的含量及氨基酸态氮/总氮的比例，以分析不同乳酸菌添加剂对甜高粱青贮饲料发酵品质的影响，结果如表8所示。

表8 乳酸菌添加剂对甜高粱青贮饲料发酵品质的影响Table8 Effect of lactic acid bacteria additive on fermentation quality of sweet sorghum silage

由表8可知，从氨基酸态氮/总氮比值来看，添加菌剂组氨态氮/总氮比值均低于对照组。氨基酸态氮与总氮的比值是反应青贮饲料中蛋白质分解程度，比值越大，说明青贮饲料中蛋白质分解越多，青贮品质越差[20]。实验组中添加量为1.5 mL/kg的处理组氨基酸态氮/总氮比值最低，为7.43%，比对照组低了2.67%，表明蛋白质降解最少，说明该处理组发酵品质优于其他组；从有机酸的含量来看，乳酸、乙酸、丙酸的含量较对照均增加，各处理组均未检测出丁酸的存在，丁酸由酪酸菌产生，可反应青贮料的腐败程度，丁酸越多，青贮饲料越腐败。青贮质量的优劣取决于乳酸菌的作用，乳酸菌的主要代谢产物是乳酸，因此乳酸的含量反映了青贮的质量[21]。各处理组乳酸含量均显著高于对照组（P＜0.05），其中1.5 mL/kg组乳酸含量最高，为9.34 g/kg，比对照高了177.15%，比美国组、台湾组分别高出29.9%、31.18%；1.0mL/kg组乳酸含量较对照高了175.07%；0.5mL/kg组较对照高了153.11%；自制混合型乳酸菌剂中存在的异型乳酸菌Lac4发酵除生成乳酸外，还通过果胶聚糖单磷酸盐途径生成乙酸和二氧化碳，乙酸有很强的抗真菌功能，乙酸含量的提高会提高青贮物的有氧稳定性。从发酵后乙酸的含量来看，实验组均高于对照组，除2.0 mL/kg组外，其他各组乙酸含量与对照相比均存在显著性差异（P＜0.05），其中，0.5 mL/kg组乙酸含量最高，为8.58 g/kg，比对照高了5.67g/kg；1.5mL/kg组次之，较对照高了3.77 g/kg；美国组、台湾组分别比对照高了2.29 g/kg、2.06 g/kg。丙酸可抑制真菌繁殖，防止二次发酵，提高青贮的有氧稳定性。从丙酸含量来看，实验组均显著高于对照组（P＜0.05），其中，1.0 mL/kg组最高，为2.86g/kg；1.5 mL/kg组次之，为2.73 g/kg，分别比对照高了1.97 g/kg、1.84 g/kg；美国组和台湾组分别较对照组高了1.41 g/kg、0.72 g/kg。

2.5 甜高粱青贮饲料质量评价综合得分

通过pH得分、氨基酸态氮/总氮得分、以及各有机酸所占比例的得分，综合评价甜高梁青贮饲料质量，结果如表9所示。

表9 甜高粱青贮饲料质量评价综合得分结果Table9 Comprehensive score results of quality evaluation of sweet sorghum silage

由表9的综合评分可得，自制乳酸菌复合菌剂添加量为1.0 mL/kg、1.5 mL/kg、2.0 mL/kg时，青贮甜高梁质量评价为优等；0.5 mL/kg组、2.5 mL/kg组质量综合评价为良好自制组评分均高于商品菌剂台湾组和美国组。说明自制乳酸菌复合菌剂可以提高甜高梁青贮品质。

3 结论

本研究通过测定分析5组不同添加剂量的自制复合乳酸菌剂以及美国、台湾商品青贮菌剂对甜高梁秸秆青贮后的感官评价，营养成分以及发酵品质，综合评价青贮品质，以探讨自制复合乳酸菌剂对甜高梁秸秆青贮的最佳添加量。研究发现，添加量为1.5 mL/kg时，其乳酸含量比对照高了177.15%，比美国组、台湾组分别高出29.9%、31.18%；粗蛋白含量较对照高了25.61%，总糖含量较对照高18.18%，比美国组、台湾组分别高出14.01%、6.81%，综合来看，1.5 mL/kg实验组甜高梁青贮品质优于美国、台湾组，也优于其他各剂量实验组，这对确定自制复合乳酸菌青贮菌剂的最佳添加量意义重大，对实验室自制青贮菌剂的推广和应用奠定了一定的基础。