青霉菌对刚毛藻纤维素降解的研究

梁宝东，魏海香，边清鹏，姜淑喆

青霉菌对刚毛藻纤维素降解的研究

梁宝东1，魏海香1，边清鹏1，姜淑喆2

（1.济宁学院 生命科学与工程系，山东 曲阜 273155；2.山东大学 生命科学学院，山东 济南 250013）

研究了青霉菌对刚毛藻中纤维素的降解条件。首先通过单因素试验，研究了氮源种类、硫酸铵含量、料液比、pH、发酵温度、发酵时间对纤维素降解的影响。选择了pH值、料液比、硫酸铵含量进行L9（33）正交试验设计，考察各因素对蛋白、总糖含量、纤维素酶活的影响，得出最佳降解条件：藻粉3 g/L，料液比1∶15（g∶mL），硫酸铵20 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.5 g/L，缓冲液pH 6.0，发酵温度为30℃，发酵时间为7 d，在此条件下，蛋白含量为12.44 g/100 g，总糖含量0.58 mg/g，纤维素酶酶活4.84 U/g。

刚毛藻；青霉菌；降解；纤维素

海藻作为可再生资源数量巨大，而且是可开发利用的重要资源［1］。在地球上通过藻类的光合作用每年产生的物质有40%。大部分海藻的主要成分是多糖等营养物质，约有50%～60%，纤维素、半纤维和少量的木质素占40%～50%，还有少量灰分。以藻类作为原料开发生物活性物质，其资源丰富，且具有藻体比较柔软、本身机械强度较低，容易破碎和降解，对设备要求低等优点［2］。提高海藻资源的利用率，以充分实现海藻的价值，是海藻资源开发利用的重要内容［3-4］。我国的海藻养殖技术居于世界领先地位。据联合国粮农组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）的统计，中国海带养殖产量占到世界的70%以上［5］。海洋被认为是21世纪支撑未来社会经济发展的重要物质基础，海洋资源的开发利用已成为各国可持续发展的重要战略［6］。

刚毛藻属于绿藻门，刚毛藻科，不仅种类繁多，而且分布广泛，在海水、淡水中都存在。刚毛藻中纤维素含量较高，其纤维素、半纤维素、木质素、水分和灰分含量分别为31.2%、17.1%、13.6%、5.83%和26.5%。杨楠楠等［7］研究了刚毛藻纤维素的酶解工艺。刚毛藻生长控制条件的报道较多［8］，利用霉菌产生纤维素酶直接降解刚毛藻中纤维素少见报道，更多的研究集中在里氏木霉、绿色木霉等菌种产纤维素酶能力和酶学分析上［9-10］。本试验研究青霉菌降解刚毛藻中纤维素，以期为刚毛藻中糖类及蛋白质等生物活性物质的提取分离提供方法和理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

刚毛藻：采集于滨海海洋刺参养殖池塘，晾干后机械粉碎，过40目筛，备用。

青霉菌：自行从鸡粪中筛选得到的青霉菌，济宁学院生命科学实验中心保藏。

酵母膏、琼脂、蛋白胨（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸钠、苯酚、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20g/L，pH自然；种子培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20L，pH自然；发酵培养基：藻粉3g/L，硫酸铵10 g/L，酵母膏1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.5 g/L，料液比1∶15（g∶mL），pH 5.0。

1.2仪器与设备

DELTA320pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PL203电子精密天平：巩义市予华仪器有限责任公司；THZ-100恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；ST16高速离心机：北京联合科力科技有限公司；HYP-1004消化炉、102C定氮仪：上海纤检仪器有限公司；722可见分光光度计：上海菁华科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1培养方法

将4℃冰箱保存的青霉菌接种于试管斜面培养基30℃培养3 d，每支斜面菌种加无菌水5 mL，取1 mL转接入100 mL/250 mL三角瓶种子培养基中，180 r/min、30℃摇床培养1 d作为种子，按10%的接种量转接入100 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，30℃、150 r/min培养7 d，4 000 r/min离心5 min，离心结束后取上清液测定总糖含量和酶活，余下的固体用烘箱干燥，干燥完成后用研钵研粹固体并取一定量测定蛋白质含量。

1.3.2单因素试验

氮源种类：在发酵培养基中，分别以酵母膏、蛋白胨、硝酸钠代替培养基中的硫酸铵为氮源，含量为10 g/L，其他成分不变，考察氮源种类对发酵的影响。

硫酸铵质量浓度：在发酵培养基中，分别按照5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L添加硫酸铵，其他成分不变，考察硫酸铵质量浓度对发酵的影响。

pH值：将发酵培养基的pH分别调整为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，考察pH值对发酵的影响，其他成分不变，考察pH对发酵的影响。

料液比：将发酵培养基的料液比分别调整为1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18（g∶mL），其他成分不变，考察料液比对发酵的影响。

发酵时间：将发酵时间分别设定为4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，考察发酵时间对发酵的影响。

发酵温度：将发酵温度分别设定为15℃、25℃、30℃、35℃、40℃，考察发酵温度对发酵的影响。

1.3.3正交试验

在单因素试验的基础上，以发酵液中的蛋白含量、总糖含量、酶活为评价指标，以pH值、料液比和硫酸氨质量浓度为评价因素进行3因素3水平L9（33）正交试验，各因素与水平见表1。

表1　霉菌发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Penicilliumfermentation technology optimization

1.3.4测定方法

总糖的测定：按照参考文献［11］的方法进行；羧甲基纤维素钠（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）酶活性的测定：按照参考文献［12-14］的方法进行；酶活定义：在酶催化的最适温度和最适pH条件下，每分钟催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量为1个酶活单位（U/g）；蛋白质的测定：按照参考文献［15］的方法进行。

2　结果与分析

2.1氮源种类对发酵的影响

图1　氮源种类对发酵的影响Fig.1 Effect of nitrogen sources on fermentation

由图1可知，以酵母膏作为氮源时，发酵结束时总糖含量最高，为0.28 mg/g，其次是硫酸铵，但总糖含量差距不大，而硫酸铵比酵母膏价格便宜，经济实惠，使用方便，酵母膏是粘稠状半固体不容易取；发酵液中以硫酸铵作为氮源时蛋白质含量最高，为13.89 g/100 g，其次是硝酸钠，彼此蛋白质含量差距较大，影响显著；发酵液中以蛋白胨为氮源时，纤维素酶酶活最高，为10.90 U/g，其次是硝酸钠，可能是由于蛋白胨和硝酸钠为氮源时产酶高峰期较晚，因此酶活高、总糖低；而硫酸铵和酵母膏产酶较早，因此酶活低、总糖高。综合各方面考虑，选择硫酸铵为最适氮源。

2.2硫酸铵质量浓度对发酵的影响

由图2可知，随着硫酸铵质量浓度的增加，发酵液中粗蛋白含量也增加，在硫酸铵质量浓度＞15 g/L后，粗蛋白含量增加不明显；这是因为菌在生长过程中要利用氮源生长。由于在霉菌生长过程中糖既可被利用，又可生成，因此变化趋势不明显，集中在0.35～0.45 mg/g；纤维素酶酶活在硫酸铵质量浓度为15 g/L时最高，为11.25 U/g，原因可能是菌体生长到一定时期，达到了产酶的高峰。综合各方面考虑，选择硫酸铵质量浓度为15 g/L。

图2　硫酸铵含量对发酵的影响Fig.2 Effect of ammonium sulfate content on fermentation

2.3 pH对发酵的影响

图3　pH对发酵的影响Fig.3 Effect of pH on fermentation

由图3可知，在pH为5.0时，粗蛋白含量最高，达到10.72g/100 g；在pH为3.0时，总糖含量最高，达到0.91 mg/g，发酵初期，发酵液中存在的单糖抑制了纤维素酶的产生，产生了葡萄糖效应，故总糖含量比其他同阶段生长的要高。酶活在pH 5.0时最高，达到5.87 U/g。综合各方面考虑，选择pH5.0为最适pH值。

2.4料液比对发酵的影响

图4　料液比对发酵的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on fermentation

由图4可知，随料液比的增大，粗蛋白含量由7.05 g/100 g增加至9g/100g；总糖含量变化较小；酶活起初变化不明显，料液比由1∶9（g∶mL）增加到1∶12（g∶mL），增长较为明显，由5.98 U/g增加至6.68 U/g，料液比高于1∶12（g∶mL）以后，增加缓慢，最终达到6.97 U/g。增大料液比，会降低降解后各种活性物质的提取效果，同时还会增加水的用量，增加提取成本，综合以上情况，料液比选择1∶12（g∶mL）较为合适。

2.5发酵时间对发酵的影响

图5　发酵时间对发酵的影响Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation

由图5可知，随着培养时间的增加，霉菌生长蛋白质含量、酶活和总糖含量均逐渐增加，在第7天时均达到最高，纤维素酶活为5.41 U/g，蛋白质含量为8.66 g/100 g，总糖含量达到0.76 mg/g，第8天时蛋白质含量减少，可能是因为随菌体的生长蛋白质含量增加，在菌体死亡自溶时蛋白质含量减少；酶活增加是因为菌体生长到一定时期会产纤维素酶，到第8天时减少可能是纤维素酶被分解了；总糖含量的变化趋势与蛋白相似，因为霉菌产的纤维素酶是胞外酶，分解刚毛藻中的纤维素使得总糖含量一直增加，在第8天的时候糖减少，可能是因为糖被利用了。综合来看，发酵时间选择7 d较为合适。

2.6发酵温度对发酵的影响

图6　发酵温度对发酵的影响Fig.6 Effects of fermentation temperature on fermentation

由图6可知，粗蛋白及纤维素酶活均随发酵温度先增加后减少，在30℃的时候最高，粗蛋白含量为8.78 g/100 g，纤维素酶活为7.54U/g。发酵温度过高，导致纤维素酶酶活失活。总糖含量的变化不大，在30℃最高，为0.34 mg/g。因此选择30℃为最适发酵温度。

2.7霉菌发酵工艺优化正交试验

以发酵液中的粗蛋白含量、总糖含量、纤维素酶酶活为测定指标，对pH值、料液比和硫酸铵质量浓度3个因素进行L9（33）正交试验。结果见表2。

表2　霉菌发酵工艺优化正交试验结果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for mold fermentation technology optimization

由表2的极差分析可知，当以蛋白含量为评价指标时，各因素影响的主次顺序为氮源质量浓度＞pH＞料液比，最优组合为A1B3C3。当以总糖含量为评价指标时，因素的主次顺序为氮源浓度〉料液比〉pH，最优组合为A3B3C3。当以纤维素酶活为评价指标时，因素的主次顺序为氮源浓度＞pH＞料液比，最优组合为A1B1C3。因3组组合不统一，需进行验证试验。

2.8验证试验

由于研究的是青霉菌对刚毛藻的降解情况，所以糖的含量是一个重要的指标，总糖含量越大代表纤维素被酶降解的程度越高，分别在上述3个最优组合条件下做验证试验，检测发酵液中总糖的含量分别为0.43 mg/g、0.58 mg/g、0.34 mg/g。所以选择青霉菌的降解最佳条件为C3B3A3，即pH值为6.0，料液比为1∶15（g∶mL），硫酸铵质量浓度20 g/L。在该条件下发酵液中蛋白含量为12.44 g/100 g，总糖含量0.58 mg/g，纤维素酶酶活4.84 U/g。

3　结论

本试验主要研究利用青霉菌进行刚毛藻中纤维素的降解，试验表明降解的最佳条件为藻粉3 g，发酵温度30℃，料液比1∶15（g∶mL），硫酸铵质量浓度20 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，缓冲液pH 6.0，结果是蛋白含量为12.44g/100 g，总糖含量0.58 mg/g，纤维素酶酶活4.84 U/g。各因素对纤维素酶活、总糖和粗蛋白的影响不同，因此在讨论菌株对海藻中纤维素降解因素时，需要定义具体的发酵条件，本试验利用霉菌对刚毛藻纤维素降解只是进行了初步探讨，降解后对其生物活性物质的分离提取的影响有待进一步研究，希望在此基础上，为海藻中生物活性成分的高效提取提供帮助。

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Degradation of cellulose inCladophorabyPenicillium

LIANG Baodong1，WEI Haixiang1，BIAN Qingpeng1，JIANG Shuzhe2
（1.Department of Life Science and Engineering，Jining University，Qufu 273155，China；2.College of Life Science，Shandong University，Jinan 250013，China）

The degradation conditions of cellulose inCladophorabyPenicilliumwere researched.The effects of the nitrogen sources，ammonium sulfate content，solid-liquid ratio，pH，fermentation temperature and time on cellulose degradation were researched by single factor experiments.The effects of pH，solid-liquid ratio and ammonium sulfate content on protein content，total sugar content and cellulase activity were investigated by L9（33）orthogonal experiments.The optimum degradation conditions were algae powder 3 g/L，solid-liquid ratio 1∶15（g∶ml），ammonium sulfate 20 g/L，potassium dihydrogen phosphate 1 g/L，magnesium sulfate 0.5 g/L，buffer solution pH 6.0，fermentation temperature 30℃and time 7 d.Under the conditions，protein content，total sugar content and cellulase activity were 12.44 g/100 g，0.58 mg/g and 4.84 U/g，respectively.

Cladophora；Penicillium；degradation；cellulose

TS254.2

0254-5071（2016）07-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.028

2016-03-09

济宁市产学研合作计划项目（2014jnkj02）

梁宝东（1979-），男，讲师，硕士，研究方向为微生物发酵及生物活性物质。