槲皮素及其两种配合物清除亚硝酸钠的活性研究

虎春艳，刘海鸥，赵声兰，林玉萍

槲皮素及其两种配合物清除亚硝酸钠的活性研究

虎春艳，刘海鸥，赵声兰，林玉萍*

（云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500）

采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺法测定了槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B三种物质对亚硝酸钠的清除率。结果表明，槲皮素及其配合物对亚硝酸钠具有一定的清除作用，且槲皮素-Al及槲皮素-B配合物对亚硝酸钠的清除率明显高于槲皮素。在最佳反应条件下，即质量浓度为0.4 mg/mL的清除剂用量1.2 mL，反应温度50℃，反应时间30 min，槲皮素对亚硝酸钠的清除率为25.8%，而槲皮素-Al和槲皮素-B对亚硝酸钠的清除率分别达到了80.2%和84.1%，且槲皮素-B的清除率稍高于槲皮素-Al。

槲皮素；槲皮素-Al；槲皮素-B；亚硝酸钠

蔬果和肉制品是人类日常生活中不可或缺的食物。为了保持肉品和腌制蔬菜的颜色，防止在储存过程中氧化，抑制肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）等。亚硝酸盐常作为发色剂和防腐剂在肉制品加工过程中使用［1-2］。日常食用的蔬菜、水果及剩菜，随着放置时间的延长，在细菌等微生物的作用下，也会产生亚硝酸盐［1］。在弱酸性环境下，亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应可生成强致癌物N-亚硝胺。此外，亚硝酸盐可使血液中正常携氧的低铁血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白而引起组织缺氧，严重的可致脑部缺氧［3］。所以，采取清除食物中的亚硝酸盐、阻断合成亚硝胺，是有效防止亚硝胺致癌、组织缺氧的有效途径［1］。某些植物提取物，如荔枝皮色素、大蒜浸提液等物质富含黄酮或多酚类化合物，均具有清除亚硝酸盐的作用［4-6］。

槲皮素（quercetin）广泛存在于水果、蔬菜和茶叶等植物中，是人类饮食中黄酮类化合物的主要来源。槲皮素及其衍生物在植物界分布广泛，是具有多种生物活性的黄酮类化合物，在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖等方面表现出较好的生物活性［7-9］。此外，槲皮素与一些金属离子能形成配合物，其配合物也大多具有良好的生物活性。近年来，国内外合成的槲皮素配合物已达到了几十种，这些配合物大多表现出较好的生物活性，尤其是在抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等方面表现显著［10-15］。文献报道，槲皮素与铅离子（Al3+）能生成稳定的槲皮素-Al配合物，并能对牛血清蛋白具有荧光猝灭作用［16］。槲皮素与三氟化硼（BF3）也易形成稳定的槲皮素-B配合物。

本试验着重研究了槲皮素及其两种配合物对亚硝酸钠的清除作用，并考察了其反应时间、反应温度及用量对亚硝酸钠清除率的影响，以期为槲皮素及其配合物的生物活性研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

槲皮素（纯度99%）：上海将来生化试剂有限公司；盐酸萘乙二胺（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；无水对氨基苯磺酸（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；无水三氯化铝、三氟化硼乙醚溶液（质量分数为47%）：国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、无水乙醇、乙酸乙酯、盐酸（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2仪器与设备

UV-2450型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；CP214型电子分析天平：奥豪斯仪器有限公司；H.H.S11-4R电热恒温水浴锅：上海医疗器械股份有限公司医疗器械五厂。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

0.4 mg/mL槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B溶液的配制：分别准确称取20 mg槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B，用无水乙醇溶解后，定容至50 mL容量瓶中。

5 μg/mL亚硝酸钠标准使用液的配制：准确称取0.050 0 g亚硝酸钠，用蒸馏水定容至250 mL容量瓶中，得到200 μg/mL亚硝酸钠储备液，准确量取储备液2.5 mL，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，备用。

0.2%盐酸萘乙二胺溶液的配制：精确称取0.100 0 g盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容至50 mL容量瓶中，避光保存。

0.4%对氨基苯磺酸溶液的配制：精确称取0.400 0 g对氨基苯磺酸，用体积分数20%盐酸溶液定容至100 mL容量瓶中，避光保存。

1.3.2配合物的合成

（1）槲皮素-Al配合物的合成

准确称取槲皮素200 mg溶于50 mL无水乙醇中，在不断搅拌下加入无水三氯化铝（AlCl3）88.3 mg，充分搅拌2 h反应完全后，40℃减压蒸馏，所得黄棕色固体物质避光自然挥发干燥，备用［16］。

（2）槲皮素-B配合物的合成

准确称取槲皮素200 mg，加入20 mL三氟化硼（BF3）乙醚溶液，于130℃搅拌加热回流50 min，得黄褐色溶液，冷却至室温，有黄褐色粉末固体析出，过滤，固体物质用无水乙醚洗涤3次，所得黄褐色固体物质避光自然挥发干燥，备用［17］。

1.3.3槲皮素及其配合物清除亚硝酸钠的影响因素

研究槲皮素及其配合物在不同反应时间、不同反应温度及不同清除剂用量时对亚硝酸钠的清除效果。反应时间设定为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min；反应温度设定为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃；槲皮素及其配合物的用量设定为0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL。

1.3.4亚硝酸钠清除率的测定

弱酸性条件下，亚硝酸钠与对氨基苯磺酸发生重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物，通过测定相同条件下亚硝酸钠含量的变化，来反映槲皮素及其配合物对亚硝酸钠的清除率［4］。

准确吸取5 μg/mL的亚硝酸钠溶液2 mL于25 mL具塞试管中，添加一定量的清除剂，在一定温度下反应一段时间，反应结束后，立即加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸，摇匀后静置5 min，加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀静置15 min，在波长534 nm处测定吸光度值，平行测定3次求平均值。亚硝酸钠清除率计算公式如下：

式中，A0为未加待测液时亚硝酸钠的吸光度值，A为加入待测液时亚硝酸钠的吸光度值。

2　结果与分析

2.1槲皮素及其配合物的紫外-可见吸收光谱

图1　槲皮素及槲皮素-Al和槲皮素-B配合物的紫外-可见吸收光谱Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of quercetin，quercetin-Al and quercetin-B

图1是槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B配合物的紫外-可见光谱吸收图。由图1可知，槲皮素在波长255 nm和370 nm处有两个吸收峰，255 nm吸收带由苯甲酰生色团产生，属于π→π*电子跃迁；370 nm吸收带由肉桂酰生色团产生，属于n→π*电子跃迁，其环上的羟基为酚羟基或烯醇式羟基，容易作为电子供体与Al（III）等金属配位［18］。

当槲皮素与AlCl3和BF3形成配合物后，槲皮素的两个吸收峰分别红移至266 nm和426 nm，说明配位后，槲皮素分子的电子结构发生了显著变化，分子中的共轭增大，生成了稳定配合物，与文献报道一致［16-18］。

2.2不同用量的槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响

考察质量浓度为0.4 mg/mL的槲皮素及其配合物的不同用量对亚硝酸钠清除率的影响，结果见图2。

由图2可知，当用量为0.3～1.2 mL时，随着槲皮素及其配合物用量的增加，亚硝酸钠的清除率逐渐增大，且槲皮素配合物对亚硝酸钠的清除率始终大于槲皮素，这可能是由于配位化合物生成后，增加了酚羟基的活性［10］；当用量为1.2 mL时，槲皮素对亚硝酸钠的清除率到达最大，为24.3%，槲皮素-Al和槲皮素-B对亚硝酸钠的清除率也达到最大，分别为81.9%和83.4%；当用量＞1.2 mL以后，增加槲皮素及其配合物的用量，其对亚硝酸钠的清除率变化不是太大。因此，选择槲皮素及其两种配合物的用量为1.2 mL。

图2　不同用量的槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响Fig.2 Effect of different addition of quercetin and its complexes on scavenging rate of sodium nitrite

2.3不同反应温度槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响

考察不同反应温度时，质量浓度为0.4 mg/mL、用量为1.2 mL的槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响，结果见图3。

图3　不同反应温度槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响Fig.3 Effect of different reaction temperature of quercetin and its complexes on scavenging rate of sodium nitrite

由图3可知，随着反应温度的增加，槲皮素对亚硝酸钠的清除率呈先增加后下降的趋势，而槲皮素配合物对亚硝酸钠的清除率呈先增加后趋于平缓的趋势。当反应温度为50℃时，槲皮素对亚硝酸钠的清除率达到最大，为24.9%，槲皮素-Al及槲皮素-B配合物对亚硝酸钠的清除率明显上升，分别达到了74.1%和78.3%；当反应温度＞50℃后，槲皮素对亚硝酸钠的清除率反而降低，这可能是高温使槲皮素中的酚羟基稳定性降低，因此活性随之降低；而其两种配合物对亚硝酸钠的清除率变化不大，原因可能是槲皮素分别与Al和B配位后，稳定性更好，清除亚硝酸钠的活性也随之更好。故选择最佳反应温度为50℃。

2.4不同反应时间槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响

考察不同反应时间，反应温度为50℃时，质量浓度为0.4 mg/mL、用量为1.2 mL的槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响，结果见图4。

图4　不同反应时间对槲皮素及其配合物对亚硝酸钠清除率的影响Fig.4 Effect of different reaction time of quercetin and its complexes on scavenging rate of sodium nitrite

由图4可知，随着反应时间的增加，槲皮素对亚硝酸钠的清除率影响较小，在反应时间为10～30min时，槲皮素-Al及槲皮素-B配合物对亚硝酸钠的清除率随反应时间的增加而增加；当反应时间为30 min时，槲皮素对亚硝酸钠的清除率达到最大，为25.8%，槲皮素-Al和槲皮素-B对亚硝酸钠的清除率分别为80.2%和84.1%，之后随反应时间的增加，其清除率变化较小。故设定最佳反应时间为30 min。

3　结论

本试验研究了槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B配合物对亚硝酸钠的清除效果。结果表明，槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B配合物对亚硝酸钠有一定的清除作用，且槲皮素-Al及槲皮素-B配合物对亚硝酸钠的清除率明显高于槲皮素。在最佳反应条件下，即质量浓度为0.4 mg/mL的槲皮素及其配合物用量1.2 mL，反应温度50℃，反应时间30 min，槲皮素对亚硝酸钠的清除率为25.8%。槲皮素-Al和槲皮素-B配合物的清除率分别达到了80.2%和84.1%。研究结果表明，槲皮素与AlCl3和BF3络合生成配合物后，对亚硝酸钠具有较好的清除活性，为槲皮素及槲皮素配合物生物活性的深入研究提供了参考。

［1］姚骏，陈闯，佟永薇.亚硝酸盐安全性研究现状［J］.食品研究与开发，2015，36（7）：136-139.

［2］刘广福，王硕，朱兴旺，等.接种发酵和自然发酵酸菜的亚硝酸盐含量对比分析［J］.中国酿造，2013，32（7）：74-76.

［3］张强，王松华，孙玉.10种香辛调味料提取物对亚硝酸盐清除能力的研究［J］.食品工业科技，2015，36（17）：100-103.

［4］宋茹，韦荣编，胡金申，等.荔枝皮色素体外清除亚硝酸盐作用研究［J］.食品科学，2010，31（5）：104-107.

［5］黄俊生.南姜表皮花青素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究［J］.中国中药杂志，2012，37（2）：243-245.

［6］秦卫东，王忠.芦荟清除亚硝酸盐的能力及其在肉制品中的作用［J］.食品科技，2005，30（12）：20-23.

［7］LI X M，ZHENG T S，SANG S M，et al.Quercetin inhibits advanced glycation end product formation by trapping methylglyoxal and glyoxal［J］. J Agr Food Chem，2014，62：12152-12158.

［8］SUZGEC-SELCUK S，BIRTEKS A S.Flavonoids ofHelichrysum chasmolycicumand its antioxidant and antimicrobial activities［J］.S Afr J Bot，2011，77（1）：170-174.

［9］王艳芳，王新华，朱宇同.槲皮素药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，2012，15（2）：171-173.

［10］郭艳华.第一过渡金属对槲皮素的化学改性及抗氧化活性［J］.中国酿造，2013，32（1）：107-109.

［11］CHEN X，TANG L J，SUN Y N，et al.Syntheses，characterization and antitumor activities of transition metal complexes with isoflacone［J］.J Inorg Biochem，2010，104（4）：379-384.

［12］WAND H F，SHEN R，WU J C，et al.Antitumor activity and DNA-binding investigations of the Zn（II）and Cu（II）compleses with isoeuxanthone［J］.Chem Pharm Bull，2009，57（8）：814-818.

［13］ZWANG T J，SINGH K，JOHAL M S，et al.Elucidation of the molecular interaction between cisplatin and flavonol（s）and their effect on dna binding［J］.J Med Chem，2013，56（4）：1491-1498.

［14］ALEXANDRA P，GLORIA M，CHRISTINA L，et al.Understanding zinc（II）chelation with quercetin and luteolin：a combined NMR and theoretical study［J］.J Phys Chem B，2015，119（1）：83-95.

［15］LI Y，YANG Z Y，WANG M F.Synthesis，characterization，DNA binding properties and antioxidant activity of Ln（III）complexes with hesperetin-4-one-（benzoyl）hydrazine［J］.Eur J Med Chem，2009，44（11）：4585-4595.

［16］李慧峰，李萍，李迎，等.槲皮素-铝配合物合成过程中紫外-可见时间分辨吸收光谱［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（2）：352-355.

［17］KATSUHIKO O，JUNKO H，HIROYUKI Y，et al.Synthesis，crystal structure，and electron-accepting property of the BF2complex of a dihydroxydione with a perfluorotetracene skeleton［J］.Org Lett，2009，11（19）：4326-4329.

［18］林天乐，严宝珍，胡高飞.Al（III）-槲皮素的光谱分析［J］.分析化学，2006，34（8）：1125-1128.

Activity of quercetin and its two quercetin complexes on sodium nitrite scavenging

HU Chunyan，LIU Haiou，ZHAO Shenglan，LIN Yuping*
（College of Traditional Chinese Medicine，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

The scavenging rate of quercetin，quercetin-Al and quercetin-B on sodium nitrite was determined by aminobenzene sulfonic acid-hydrochloric acid naphthalene ethylenediamine method.The results showed that quercetin and its quercetin complexes had a certain scavenging activity on sodium nitrite.The scavenging rate of quercetin-Al and quercetin-B on sodium nitrite was significantly higher than that of quercetin.Under the optimal reaction conditions of 0.4 mg/ml scavenging agent addition 1.2 mL，reaction temperature 50℃and temperature 30 min，the scavenging rate of quercetin on sodium nitrite was 25.8%，while the scavenging rate of quercetin-Al and quercetin-B on sodium nitrite were 80.2%and 84.1%，respectively.The scavenging rate of quercetin-B was slightly higher than that of quercetin-Al.

quercetin；quercetin-Al；quercetin-B；sodium nitrite

TS201.2

0254-5071（2016）07-0147-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.032

2016-03-01

云南省教育厅项目（2013y239），云南省教育厅重点项目（2014z119）

虎春艳（1979-），女，讲师，硕士，研究方向为天然产物活性成分及配合物合成。

林玉萍（1975-）女，副教授，硕士，研究方向为天然药物活性成分。