超声波提取灰树花菌丝体蛋白工艺优化

黄　忠，汤庆莉，吴天祥，朱思洁，杨祖滔

超声波提取灰树花菌丝体蛋白工艺优化

黄忠，汤庆莉*，吴天祥，朱思洁，杨祖滔

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

为了获得提取率高的灰树花菌丝体蛋白，以灰树花菌丝体为原料，采用超声波提取灰树花菌丝体蛋白。在单因素试验基础上，采用正交试验设计，以蛋白提取率为评价指标，对提取工艺条件进行优化。结果表明，最佳提取条件为液料比95∶1（mL∶g），超声功率600 W，超声温度35℃，超声时间3 min，pH 10.5，在该条件下，灰树花菌丝体蛋白提取率为（5.10±0.04）%。

灰树花；菌丝体蛋白；超声波；提取；优化

灰树花（Grifola frondosa）俗称“栗子蘑”，又名贝叶多孔菌、莲花菌等，隶属于担子菌纲、多孔菌目。灰树花子实体肉质柔软，营养丰富，是一种高档珍稀食用菌，同时灰树花还是一种十分珍贵的药用真菌［1-2］。灰树花中的化学成分主要包括多糖、蛋白质、核酸、多酚等，除多糖外，灰树花中含量较高的另一种功能性成分是蛋白质，灰树花蛋白中含有多种对人体有利的氨基酸，其必需氨基酸中异亮氨酸含量较高，有助于蛋白质的合成；还含有较高的谷氨酸和天冬氨酸，这两种氨基酸具有保护人脑神经以及抗机体疲劳的作用［3-4］。

目前研究表明，真菌蛋白已表现出显著的免疫调节和抗肿瘤抑制活性［5］。GU C Q等［6］从灰树花中提取的小分子蛋白具有抗单纯孢疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus-Ⅰ，HSV-Ⅰ）的作用。TSAO Y W等［7］研究表明，灰树花蛋白具有刺激小鼠自然杀伤树突状细胞和增强小鼠抗肿瘤免疫。陈宁等［8］从灰树花子实体中经分离纯化得到的具有热稳定性的灰树花蛋白，能够抑制烟草花叶病毒。NANBA H等［9］最早发现了灰树花中的抗肿瘤多糖，其组分中含有的1%～20%的蛋白可能具有独特作用。

国内对灰树花菌丝体蛋白的提取工艺鲜有报道。真菌蛋白的提取方法一般采用的碱提法或水浸提法，但耗时长而且效率较低［10-13］；为提高提取效率和缩短提取时间，本实验采用超声波提取灰树花菌丝体蛋白，通过单因素试验及正交试验对提取条件进行优化，以期为灰树花菌丝体蛋白的进一步深入地研究提供基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

灰树花（Grifola frondosa）菌株（菌种编号51616）：中国微生物菌种保藏管理中心；考马斯亮蓝G-250（分析纯）、牛血清蛋白（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；KH2PO4（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；酵母膏（分析纯）、蛋白胨（分析纯）：上海盛思生化科技有限公司；MgSO4·7H2O（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：马铃薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，琼脂20 g/L，pH自然。

液体种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母膏6 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH自然。

发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然。

1.2仪器与设备

BXM-30R型立式灭菌锅、GZX-9070 MBE型数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-7502PC型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；SW-CJ-1D型净化工作台：苏州净化设备有限公司；SG8200HPT型超声波清洗机：上海冠特超声仪器有限公司；TG2-16G型低速离心机：上海安亭科学仪器厂；CP114型电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1灰树花菌丝体的培养方法

斜面种子培养：切取母种试管中黄豆大小的菌丝块，接种于PDA斜面培养基中部，放置于25℃的恒温培养箱中，培养至菌丝长满整个斜面。

液体种子培养：取蚕豆大小的斜面菌种，接种到装液量为100 mL/250 mL的液体种子培养基中，一支种子管接种一瓶。于25℃、150 r/min摇床培养7～9 d，待液体种子培养基中长出大量均匀、细小的菌丝球且发酵液清亮［14］。

发酵培养：用移液枪吸取种子液10 mL，接种于装液量为100 mL/250 mL的发酵培养基中。于25℃、150 r/min摇床培养7～9 d［15］。

1.3.2牛血清蛋白标准曲线的绘制

参照文献［16］，采用考马斯亮蓝染料比色法，精确称取10 mg牛血清蛋白标准品，加入100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容，得到0.1 mg/mL的牛血清蛋白标准液，分别取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL具塞试管中，加蒸馏水至1 mL，再分别向试管中加入配制好的考马斯亮蓝G-250溶液5 mL，摇匀，避光反应5～10 min后，在波长595 nm处测定其吸光度值，绘制牛血清蛋白标准曲线。

1.3.3样品制备及其蛋白的提取

将灰树花发酵菌丝体用纱布过滤，然后用蒸馏水反复清洗5次，得到的灰树花湿菌丝体置于60℃干燥箱中干燥约12 h至恒质量，用研钵研磨成粉末放入干燥器中备用；称取一定质量的灰树花菌丝体粉末于离心管中，加入适当比例的蒸馏水后用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液调至所需pH后，放入超声波清洗器中在一定温度和时间下提取，提取液经4 000 r/min离心20 min，上清液即为样品溶液。取0.1 mL上清液于具塞试管中，按照绘制标准曲线的方法，测定蛋白质的吸光度值，根据标准曲线回归方程计算蛋白含量。菌丝体蛋白提取率计算公式如下：

式中：Y表示蛋白提取率，%；m1表示上清液中蛋白质量，mg；m2表示灰树花菌丝体干粉质量，mg。

1.3.4单因素试验

经过前期多次的预实验，发现在超声波清洗机功率的变化范围内，提高超声功率可以增大灰树花蛋白的提取率，缩短提取时间，因此选择在最大的超声功率（600 W）条件下，考察超声温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、超声时间（1 min、5 min、15 min、30 min、60 min）、pH（7、8、9、10、11）、液料比（60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1（mL∶g））对灰树花菌丝体蛋白提取率的影响。

1.3.5正交试验设计

在单因素试验基础上，为了得到灰树花菌丝体蛋白提取的最佳工艺条件，以超声温度、超声时间、液料比、pH为考察因素，以灰树花菌丝体蛋白提取率（Y）为评价指标，采用L9（34）正交设计对灰树花菌丝体蛋白提取条件进行优化。正交试验因素与水平见表1。

表1　菌丝体蛋白提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for mycelium protein extraction process optimization

2　结果与分析

2.1牛血清蛋白标准曲线的制作

在波长595 nm处测量不同质量浓度的牛血清蛋白的吸光度值，以牛血清蛋白质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线，结果见图1。由图1可知，标准曲线回归方程式为y=8.740 5x+0.009 3，相关系数R2=0.999 2，表明牛血清蛋白质量浓度和吸光度值呈良好的线性关系。

图1　牛血清蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.2单因素试验结果

2.2.1超声温度对灰树花蛋白提取率的影响

在超声时间为5 min、液料比为80∶1（mL∶g）、pH值为9.0条件下，考察超声温度对灰树花菌丝体蛋白提取率的影响，结果如图2所示。

图2　超声温度对蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of protein

由图2可知，在超声温度30～70℃范围内，随着超声温度的增加，蛋白提取率呈先增加后降低的趋势。在超声温度为40℃时，蛋白提取率达到最大值，为4.77%。这可能由于温度过高导致部分蛋白质变性失活而降解，因此，选择超声温度40℃为宜。

2.2.2超声时间对灰树花蛋白提取率的影响

在超声温度为40℃、液料比为80∶1（mL∶g）、pH为9.0的条件下，考察超声时间对菌丝体蛋白提取率的影响，结果如图3所示。

图3　超声时间对蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of protein

由图3可知，在超声时间为5 min时，蛋白提取率达到最大值，为4.24%；继续增加超声时间，蛋白提取率开始缓慢降低，这可能由于持续强烈的振动效应和空化效应使得部分蛋白结构断裂而破坏，降低了提取率，因此，选择超声时间5 min为宜。

2.2.3 pH对灰树花蛋白提取率的影响

在液料比为80∶1（mL∶g）、超声时间为5 min、超声温度为40℃条件下，调pH至7、8、9、10、11，考察pH值对灰树花菌丝体蛋白提取率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，pH值在7～11范围内，随着pH值的增加，蛋白提取率也逐渐增加。当pH值为10时，蛋白提取率为4.77%，继续增加pH值蛋白提取率基本保持稳定。由于碱性太强会使氨基酸转变为有毒化合物，从而影响提取出的蛋白质量。因此，选择pH 10为宜。

图4　pH对蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of protein

2.2.4液料比对灰树花蛋白提取率的影响

在超声温度为40℃、超声时间为5 min、pH为10.0条件下，考察液料比对灰树花蛋白提取率的影响，结果见图5。

图5　液料比对蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of liquid-material ratio on the extraction rate of protein

由图5可知，增加液料比会促进蛋白质的溶解，当液料比为90∶1（mL∶g）时，蛋白提取率达到最大值，为4.54%；继续增加液料比，蛋白提取率开始缓慢下降，因此，选择液料比90∶1（mL∶g）为宜。

2.3正交试验结果分析

根据单因素的试验结果，设计正交试验因素水平表，采用L9（34）的正交试验设计，进行3次平行试验，正交试验结果与分析如表2所示，方差分析如表3所示。

由表2中R值可知，用超声波提取灰树花菌丝体蛋白时，蛋白提取率影响程度大小依次为pH（C）＞液料比（D）＞超声温度（B）＞超声时间（A）。最优水平组合为A1B1C3D3，即超声温度35℃，超声时间3 min，液料比95∶1（mL∶g），pH 10.5。由表3可知，pH和液料比对蛋白提取率有显著性影响（P＜0.05），超声时间和超声温度对蛋白提取率影响不显著。在最优工艺参数条件下，进行3次平行实验，测得灰树花蛋白提取率为（5.10±0.04）%。正交试验结果可靠。该提取工艺提取时间短、提取温度低、减少了能源消耗。

表2　菌丝体蛋白提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for mycelium protein extraction process optimization

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3　结论

本实验采用超声波提取灰树花菌丝体蛋白，在单因素试验的基础上，采用正交试验得到提取灰树花菌丝体蛋白的最佳工艺条件，即超声温度35℃，超声时间3 min，液料比95∶1（mL∶g），pH 10.5，工艺参数影响程度大小依次为pH＞液料比＞超声温度＞超声时间，在此条件下，灰树花菌丝体蛋白平均提取率可达（5.10±0.04）%。该方法操作简便，提取效果好，可用于工业化生产。为深入地研究灰树花蛋白的生理活性及其理化性质提供理论基础。

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Optimization of extraction technology of protein fromGrifola frondosamycelium by ultrasonic wave

HUANG Zhong，TANG Qingli*，WU Tiangxiang，ZHU Sijie，YANG Zutao
（College of of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

In order to obtain high extraction rate of protein fromGrifola frondosamycelium，theG.frondosamycelium protein was extracted by ultrasonic wave with theG.frondosamycelium as raw material.On the basis of single factor experiments，with the extraction rate of protein as the evaluation index，the extraction processing was optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were liquid-material ratio 95∶1（ml∶g），ultrasonic power 600 W，ultrasonic temperature 35℃，ultrasonic time 3 min and pH 10.5.Under the conditions，the protein extraction rate was（5.10±0.04）%.

Grifola frondosa；mycelium protein；ultrasonic wave；extraction；optimization

TS202.3

0254-5071（2016）07-0151-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.033

2016-03-31

国家自然科学基金资助项目（31460537）

黄忠（1992-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

汤庆莉（1967-）女，副教授，本科，研究方向为食品生物技术。