灰树花胞外多糖脱蛋白工艺研究

朱思洁，吴天祥，杨祖滔，黄　忠

灰树花胞外多糖脱蛋白工艺研究

朱思洁，吴天祥*，杨祖滔，黄忠

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

以脱蛋白效率和多糖损失率为评价指标，分别考察Sevag法、酶法和三氯乙酸法三种脱蛋白方法对灰树花胞外多糖的脱蛋白效果的影响。结果显示，三氯乙酸法脱蛋白优于Sevag法和酶法，三氯乙酸的最佳添加量为3%，此时的脱蛋白效率为68.40%，多糖损失率为21.11%。紫外光谱扫描结果显示，经过三氯乙酸脱蛋白处理后的灰树花胞外多糖在波长200～600 nm范围没有明显吸收峰，表明粗多糖中的蛋白已基本除去。三氯乙酸法可作为灰树花胞外多糖纯化的一种有效的脱蛋白方法。

灰树花；胞外多糖；脱蛋白

灰树花（Grifola frondosa）在日本称之“舞茸”，美国称之为“林鸡”，是一种食用药用型真菌，隶属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，子实体肉质［1］。灰树花营养丰富、生物活性物质含量高，其中灰树花胞外多糖（exopolysacccharides，EPS）是其重要的生物活性物质之一，近年来研究表明，灰树花多糖具有抗肿瘤［2-3］、清除自由基［4］、抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）［5］、抗氧化［6］、降低体内血糖水平［7］等生物活性。本课题组前期已对灰树花深层发酵液中提取胞外多糖制得粗多糖工艺做了研究［8］。但粗多糖中通常含有无机盐、单糖、寡糖、低分子质量的非极性物质及高分子质量的有机杂质（如蛋白质、木质素）等［9］。为获得灰树花胞外多糖纯品需对粗多糖制品分离纯化，其中脱蛋白是一个重要环节。目前，国内外的脱蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法和酶法等［10］。Sevag为最常用的方法，但需多次重复处理，且此法使用的氯仿是有毒物质，容易造成多糖活性下降和溶剂残留；三氯乙酸法除蛋白比Sevag法效果好，而且可以同时除掉部分色素；Sevag法和酶法联用脱蛋白可降低多糖损耗，减少操作次数，处理效果优于单一的Sevag法，但酶具有专一性且存在酶残留及酶降解产物的去除问题。本实验采用Sevag法、酶法、三氯乙酸法3种方法脱除灰树花胞外多糖，筛选出灰树花胞外多糖去蛋白最佳工艺，为进一步分析灰树花胞外多糖种类和单糖组成及其活性多糖功能活性研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

灰树花（Grifola frondosa）（菌种编号5.404）：中国微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2化学试剂

牛血清蛋白：美国Sigma公司；考马斯亮蓝：美国Amresco公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：美国Sciencelab公司；氯仿（分析纯）：重庆川东化工集团有限公司；正丁醇（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：马铃薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，琼脂20 g/L；pH自然。

液体种子培养基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏6 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH自然。

发酵培养基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏6 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L；pH自然。

培养基灭菌条件：121℃、30 min。

1.2仪器与设备

BXM-30R立式灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1D净化工作台：苏州净化设备有限公司；TDL-40B高速离心机：上海安亭科学仪器厂；TS-2102C恒温振荡器：上海天呈仪器有限公司；UV-1800双光速紫外可见光光度计：上海欣茂仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面种子培养

于母种试管中切取黄豆粒大小的菌丝块接于PDA斜面中部，置于25℃恒温培养箱中，培养至菌丝长满整个斜面。

1.3.2液体种子培养

将培养好的斜面菌种用接种扒切取蚕豆大小颗粒，接种于液体种子培养基中，一支PDA斜面接种一瓶。装液量100 mL/250 mL，25℃、150 r/min摇床培养4～7 d。

1.3.3发酵培养基

按10%的接种量接种。用移液管量取液体种子，接种于发酵培养基中。装液量为1 L/2 L，25℃、150 r/min摇床培养9 d。

1.3.4灰树花胞外多糖提取方法

灰树花发酵培养液过滤菌丝体获得发酵液，用4倍体积体积分数为95%的乙醇4℃醇沉24 h，再经过4000r/min离心15 min，用体积分数为95%的乙醇清洗2次后用真空冷冻干燥获得灰树花胞外粗多糖。

1.3.5灰树花胞外粗多糖脱蛋白方法

（1）Sevag法

用蒸馏水配制1%的粗多糖溶液，多糖溶液与Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V）按照4∶1体积比混合，振荡30 min，离心取沉淀。取5份10 mL样品用上述步骤分别重复处理1～5次，再苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定每组样品上清液中多糖含量和蛋白含量，计算多糖损失率和脱蛋白效率。

（2）木瓜蛋白酶法

用蒸馏水配制1%的粗多糖溶液，分别在不同的木瓜蛋白酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH（4、5、6、7、8）、酶解温度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）、酶解时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）条件下处理，沸水浴灭酶5 min，冷却至室温，4 000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清液中加入4倍体积的体积分数为95%的乙醇醇沉24 h，4 000 r/min离心15 min，用体积分数为95%的乙醇清洗2次后用真空冷冻干燥获得粗多糖，加入10 mL蒸馏水复溶，测定每组样品多糖含量和蛋白含量。以多糖溶液中多糖含量和蛋白含量为考察指标来确定最佳酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解pH值。

（3）三氯乙酸法

配制1%的粗多糖溶液，取5份10mL样品分别加入TCA使其体积分数为1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，振摇30 min，4℃静置过夜，去沉淀，测定上清液蛋白质和多糖含量。

1.3.6检测分析

（1）蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝G-250法［11］，以牛血清白蛋白质为标准品进行测定，以牛血清白蛋白含量（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制蛋白标准曲线，得到标准曲线回归方程Y=0.005 1X-0.001 7（R2=0.995 6），线性范围为0～70 μg/mL。

（2）多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法［12］，以葡萄糖含量（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制蛋白标准曲线，得到葡萄糖标准曲线回归方程为Y=3.398 3X+0.003 6（R2=0.995 8），线性范围为0.01～0.08 mg/mL。

（3）紫外光谱扫描

取脱蛋白前后的多糖水溶液在波长200～600 nm范围进行紫外光谱扫描。

（4）脱蛋白效率和多糖损失率计算

式中：X为脱蛋白效率，%；C前、C后为脱蛋白前后蛋白含量，μg/mL。

式中：Y为多糖损失率，%；C前、C后为脱蛋白前后多糖含量，mg/L。

2　结果与分析

2.1 Sevag法脱蛋白效果

对灰树花胞外粗多糖溶液进行5次脱蛋白处理，每次处理后的脱蛋白效率和多糖损失率如图1所示。

图1　Sevag法脱蛋白效果Fig.1 Deproteinization efficiency of Sevag method

由图1可知，随着脱蛋白次数增加，脱蛋白效率逐渐升高，处理4次后脱蛋白效率继续增加但变化不明显。脱蛋白处理2次后，多糖损失率曲线斜率增加，多糖损失明显，在第五次多糖损失达到最大，由于Sevag试剂中氯仿属于有机有毒试剂，应尽可能避免多次使用导致多糖损失严重。所以综合考虑选择Sevag脱蛋白4次为最佳，此条件下脱蛋白效率为26.46%，多糖损失率为29.45%。结果表明，Sevag法蛋白脱除率低，这与大多数文献报道中指出的Sevag法脱蛋白温和，大部分蛋白仍与多糖结合未能去除，脱蛋白效果不明显一致［13-15］。

2.2木瓜蛋白酶脱蛋白效果

2.2.1不同酶用量对脱蛋白效果的影响

在酶解温度50℃，pH值为6.0的反应体系中，分别选用加酶量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，水解2 h后，结果见图2。由图2可知，多糖损失率随酶用量的增加逐渐增大，脱蛋白效率随酶浓度增大而降低。当酶用量为0.1%时，脱蛋白效率达到最高，而此时的多糖损失率最小，这可能是由于超过0.1%的酶用量时，木瓜蛋白酶不能继续酶解底物，溶液中过多的蛋白酶抑制了蛋白酶的活性，故选择酶用量为0.1%。

图2　不同酶用量对脱蛋白效果的影响Fig.2 Effect of different enzyme addition on deproteinization efficiency

2.2.2不同酶解pH值对脱蛋白效果的影响

图3　不同酶解pH值对脱蛋白效果的影响Fig.3 Effect of different enzymolysis pH on deproteinization efficiency

在反应温度50℃，加酶量为0.1%，分别选pH值为4、5、6、7、8的反应体系中，水解2 h后，结果见图3。由图3可知，当pH值为6时，脱蛋白效率最高，多糖损失率最小。说明此时酶的活性最高，与底物作用的效果最好。酶的催化过程，pH环境可直接影响酶的活性，过酸或过碱都会使酶的活性降低甚至失去活性，故选择pH 6为最适宜pH。

2.2.3不同酶解时间对脱蛋白效果的影响

在反应温度50℃，加酶量为0.1%，pH值为6的反应体系，酶解时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）条件下处理，结果见图4。由图4可知，酶解时间在1.5 h时脱蛋白效果最好，说明此时酶的活性最高，而反应时间＞1.5 h后，随着酶解时间增加多糖继续损失，脱蛋白效率也明显降低。故选择1.5 h为最佳酶解时间。

图4　不同酶解时间对脱蛋白效果的影响Fig.4 Effect of different enzymolysis time on deproteinization efficiency

2.2.3不同酶解温度对脱蛋白效果的影响

图5　不同酶解温度对脱蛋白效果的影响Fig.5 Effect of different enzymolysis temperature on deproteinization efficiency

在加酶量为0.1%，pH值为6的反应体系，酶解时间1.5h，酶解温度分别为（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）条件下处理，结果见图5。由图5可知，当酶解温度为50℃时脱蛋白效果最好，尽管酶解温度高于50℃以后多糖损失率变化不明显，但继续升高酶解温度脱蛋白效率降低，说明可能由于温度升高酶活性降低或者部分失活导致脱蛋白效率降低。故选择50℃为最佳酶解温度。

综上所述，木瓜蛋白酶脱去灰树花胞外多糖蛋白质的最佳工艺为酶用量0.1%、酶解pH6、酶解时间1.5 h、酶解温度50℃。此条件下，脱蛋白效率为46.86%，多糖损失率为59.91%。酶法脱蛋白效果不佳，这可能与酶的专一性有关。酶法的多糖损失率高，这与粗多糖中的杂蛋白可能以糖蛋白的形式结合存在，酶法去蛋白的同时部分糖蛋白也损失。

2.3三氯乙酸脱蛋白效果

图6　三氯乙酸法脱蛋白效果Fig.6 Deproteinization efficiency of trichloroacetic acid method

由图6可知，随着TCA添加量的增加，脱蛋白效率和多糖损失率均呈上升趋势，当TCA添加量在3.0%时脱蛋白效率达到最大，继续增加TCA添加量脱蛋白效率变化不明显，但多糖损失率升高，为尽可能降低多糖损失，故选择TCA最佳添加量3.0%，此条件下脱蛋白效率为68.40%，多糖损失率为21.11%。而溶液中残留的三氯乙酸可在多糖的进一步纯化过程中通过凝胶柱层析法洗脱。此项研究结果在其他文献报道中得到证实，王金玲等［16］在桦褐孔菌胞外多糖脱蛋白工艺比较研究中通过对比Sevag法、酶法、三氯乙酸法三种脱蛋白方法也得出三氯乙酸法脱蛋白效果相对较好，蛋白质脱除率为68.15%，多糖损失率为21.45%。朱美静等［17］在猴头多糖脱蛋白方法的研究中对比了Sevag法和三氯乙酸法，也表明三氯乙酸法效果最好，一次即可使蛋白脱除率达到80%，且多糖损失率小于Sevag法脱蛋白时的损失率。

2.4三种脱蛋白方法的效果对比

由图7可知，对比三种不同的脱蛋白方法，从脱蛋白效率方面可以看出脱蛋白效率最高的是三氯乙酸法可达到68.40%，其次是酶法可达到46.86%，脱蛋白效率最低的Sevag法，其脱除率为26.46%。从多糖损失率方面可以看出多糖损失率最低的是三氯乙酸法，损失率为21.11%，其次是Sevag法，损失率为29.45%，故综合考虑应选择三氯乙酸法为最佳脱蛋白方法。

图7　三种脱蛋白方法效果对比Fig.7 Comparison of deproteinization efficiency of three deproteinization methods

2.5紫外扫描的定性分析

取经TCA法脱蛋白前后的灰树花胞外粗多糖配制成1 mg/mL的水溶液在200～600 nm波长范围进行紫外光谱扫描，结果见图8。

图8　灰树花胞外多糖三氯乙酸法脱蛋白前（A）后（B）紫外吸收光谱Fig.8 Ultraviolet absorption spectrum of exopolysaccharides from G.frondosabefore（A）and after（B）deproteinization by trichloroacetic acid method

由图8可知，灰树花胞外多糖溶液脱蛋白前在波长260～280 nm范围内有明显吸收峰，说明其含有蛋白质、多肽及核酸；经TCA法处理后灰树花胞外多糖溶液紫外扫描检测，其结果显示在波长260～280nm范围内无紫外吸收，说明处理后的粗多糖溶液几乎不含蛋白质和核酸，TCA法可作为灰树花胞外多糖脱蛋白的有效方法。

3　结论

本实验以脱蛋白效率和多糖损失率为指标对比了Sevag法、酶法、三氯乙酸法三种脱蛋白方法对灰树花胞外多糖的脱蛋白效果，其中三氯乙酸法相对Sevag法、酶法脱蛋白效果更好，脱蛋白效率为68.40%，多糖损失率为21.11%，TCA最佳添加量为3%，紫外光谱扫描结果表明TCA法脱蛋白效果明显。此方法操作简单、切实可行，清除蛋白效果好，适用于灰树花胞外多糖中蛋白质的去除，为灰树花胞外多糖的进一步纯化打下了基础。

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Deproteinization technology of exopolysaccharide fromGrifola frondosa

ZHU Sijie，WU Tianxiang*，YANG Zutao，HUANG Zhong
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using the protein removal rate and polysaccharide loss rate as the evaluation indexes，the effects of deproteinization methods（including Sevag method，enzymatic method and trichloroacetic acid method on deproteinization efficiency of exopolysaccharide fromGrifola frondosawere investigated.The results showed that trichloroacetic acid method was superior to Sevag method and enzymatic method.In the condition of the optimum addition of trichloroacetic acid 3%，the protein removal rate and polysaccharide loss rate was 68.40%and 21.11%，respectively.The results of UV spectroscopy scanning showed thatG.frondosaexopolysaccharide with deproteinization treatment by trichloroacetic acid method had no obvious absorption peak in the range of 200-600 nm，which indicated that the proteins in crude polysaccharide were almost removed.Trichloroacetic acid method could be used as a kind of effective method of deproteinization in purification of extracellular polysaccharide fromG.frondosa.

Grifola frondosa；exopolysaccharide；deproteinization

TQ281

0254-5071（2016）07-0161-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.035

2016-03-31

国家自然科学基金（［2014］31460537号）

朱思洁（1991-）女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

吴天祥（1965-）男，教授，博士，研究方向为发酵工程。