氨基酸添加对荔枝酒发酵动力及品质影响

商玉荟，朱　萍，钟秋平

氨基酸添加对荔枝酒发酵动力及品质影响

商玉荟1，朱萍2，钟秋平1*

（1.海南大学 食品学院，海南 海口 570228；2.海南大学 园艺园林学院，海南 海口 570228）

分别添加质量浓度范围为60～480 mg/L的D-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺于荔枝汁中，测定其对荔枝酒的发酵动力及发酵过程中产生的非挥发性成分以及挥发性成分的影响。结果显示：添加不同种类与浓度的氨基酸可以不同程度加快可溶性固形物的消耗速率，缩短酵母发酵时间，且总醇类含量增加，酸类和酯类均有明显变化。乙醇含量由空白样的10.52%vol升高到处理样的10.71%vol～11.68%vol，而甘油的含量由6.33 g/L下降至4.17～6.04 g/L，乙醛的含量也明显降低。不同种类与浓度的氨基酸对荔枝酒的影响不同。

荔枝酒；发酵；氨基酸；挥发性成分

荔枝酒是由新鲜或冻藏荔枝为原料经酿酒酵母发酵而成，产品呈金黄色，清亮透明，甜润爽口，且富含人体所需的各种氨基酸、多种维生素及矿物质，营养价值高［1-2］。

氮源是满足酵母生长和发酵的两大重要营养素之一，果汁中的氮化物影响酵母的发酵速率、发酵持续时间及发酵风味等，对酵母的生长发酵及酒的品质具有重要的影响［3-5］。果酒发酵过程中酵母优先利用可同化氮素，包括铵态氮、游离α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，但同化氮素含量不足可能会引起发酵缓慢或终止［6-7］。游离氨基酸是果酒中发酵香气的主要前体物质，其本身具有酸、甜、苦、鲜等味道，不仅给荔枝酒提供了丰富饱满的感官特征，还与酒中的醇类、酯类、有机酸、萜烯化合物等协同构成了酒的特有风味［8］。因此，可以采取添加氨基酸的方式来保证果酒在发酵过程中所需可同化氮素的充足性，并赋予果酒独特的风味。

目前，国内外的研究主要集中于添加氨基酸对葡萄酒的发酵动力学、香气成分以及品质的影响，而关于氨基酸的添加对荔枝酒发酵及风味影响的研究鲜有报道。因此，本实验通过在荔枝酒酿造过程中添加不同种类不同浓度的氨基酸，来研究氨基酸的添加对荔枝酒的发酵动力以及品质的影响，旨在进一步提高荔枝酒的感官品质。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金澄无核荔枝：市售，去皮后冷冻保藏。

果胶酶、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DV10：上海杰兔工贸有限公司。

D-丙氨酸（D-Ala）、L-精氨酸（L-Arg）、L-谷氨酰胺（L-Glu）（分析纯）：阿拉丁试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：瑞典欧森巴克化学公司；焦磷酸钠、磷酸二氢钠等（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

酒精、乙酸和甘油测定试剂盒：德国拜发公司；丙酮酸试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2仪器与设备

GI54DW立式压力蒸汽灭菌器：致微仪器有限公司；DS-200组织捣碎机：上海垒固仪器有限公司；HH4数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；ILRH-250A生化培养箱：韶关泰宏医疗器械有限公司；AR124CN型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；BiofugePrimoR高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司；TG16-WS高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PAL-1手持糖度计：爱宕科学仪器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；Agilent 1260液相色谱仪、Agilent 6890-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司。

1.3方法

1.3.1荔枝汁的制备

将解冻后的荔枝果肉打浆，根据果浆的质量添加0.2 g/kg果胶酶，酶解2 h，纱布过滤除去果渣，添加蔗糖与苹果酸，调整荔枝汁的糖度与pH值分别为22.8°Bx和3.56。根据所得的果汁体积添加1 g/L皂土，静置24 h，取上清液进行硅藻土抽滤，离心后得澄清荔枝汁，接种前添加120 mg/L的SO2（以偏重硫酸钠的形式添加）。

1.3.2荔枝汁的发酵

酿酒酵母DV10于42℃条件下活化30 min，将活化好的酵母接种在灭菌（100℃灭菌15 min）后的荔枝汁中，20℃培养24 h，得到的酵母培养物以10%的比例接种，再分别添加60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L（添加量以氮计）的D-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺的荔枝汁中，20℃恒温发酵，以不添加氨基酸的荔枝汁作为空白对照。

1.3.3生长曲线及糖耗曲线的绘制

取1mL荔枝汁发酵液，离心后取得酵母沉淀物，添加蒸馏水洗涤，离心两次取得最终酵母沉淀物，以干重法（80℃烘干）每天测定酵母质量。以酵母质量为纵坐标，培养时间为横坐标绘得酵母生长曲线。

用手持糖度计每天测定可溶性固形物含量，以可溶性固形物含量为纵坐标，培养时间为横坐标描述可溶性固形物变化趋势。pH值：20℃恒温发酵10 d，pH计测得。

1.3.4代谢产物的测定

丙酮酸、乙酸、甘油、乙醇的测定：分别取得各样品1mL，6 000 r/min离心10 min，取上清液，稀释适当的倍数后，按照检测试剂盒说明书测定丙酮酸、乙酸、甘油、乙醇含量。

苹果酸、柠檬酸、琥珀酸的测定采用高效液相色谱法：色谱柱为Zorbax SB-aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.01 mol/L磷酸二氢铵（pH=2.62）∶甲醇=97∶3；柱温30℃；流速0.8 mL/min；进样量15 μL；检测波长215 nm。

1.3.5挥发性物质的测定

采用气质联用仪测定，AB-INowax（30.0 m×250 μm× 0.25 μm）弹性石英毛细管柱。

色谱条件：进样口温度250℃；初始柱温45℃，保持2 min，以5℃/min升温至230℃，保持20 min；载气：高纯He（99.999%）；柱流量：1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比20∶1。

质谱条件：电源方式为电子电离（electronic ionization，EI）；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；接口温度280℃；扫描质量范围10～450 amu。

1.3.6数据分析

文中所有分析数据为各组处理三次重复的平均值，利用Microsoft Excel 2010进行统计处理，SPSS 18.0进行方差分析，各平均值利用Duncan多重比较检验进行差异显著性分析（P＜0.05），绘图软件为Origin 8.0。

2　结果与分析

2.1氨基酸添加对酵母生长与发酵速率的影响

荔枝酒在发酵过程中，氨基酸缺乏会导致葡萄糖通透酶运转能力下降，进而降低发酵能力［9］。张斌等［10］认为，添加适量氨基酸的荔枝酒中游离氨基酸总量减少，氨基酸的转化能力增强，酵母发酵利用氨基酸的能力增强，进而加快了发酵速率。不同氨基酸添加量的酵母生长曲线如图1所示，氨基酸添加明显加快了发酵速率，缩短了发酵时间。随着氨基酸浓度的增加，发酵速率呈现先增大后减小的趋势。对于添加同种氨基酸，氨基酸添加量为60 mg/L的处理样发酵速率明显最低，而氨基酸添加量为240 mg/L的处理样则呈现相反的趋势。在发酵初期，与同水平的其他种类氨基酸相比，L-Gln处理样的发酵速率最快，而D-Ala处理样的发酵速率最慢。这说明浓度为240 mg/L的氨基酸添加量为荔枝酒中酵母发酵的最适添加量，添加氨基酸种类不同，发酵速率不同。

图1　酵母生长曲线Fig.1 Growth curves of yeast

2.2氨基酸添加对非挥发性组分的影响

2.2.1可溶性固形物变化

添加氨基酸及对照荔枝酒（CK）发酵的可溶性固形物含量随时间的变化结果见图2。如图2所示，在发酵过程中，发酵液中的可溶性固形物含量一直呈现下降趋势，在发酵初期，这种趋势最为明显。在初始可溶性固形物含量相同的情况下，D-Ala处理样的可溶性固形物含量始终高于L-Arg和L-Gln处理样，说明D-Ala处理样的发酵速率较慢。而发酵结束时，各样品可溶性固形物的总含量差别不大。这说明，添加氨基酸后，可溶性固形物消耗增快，糖耗速率增快。

图2　添加氨基酸对可溶性固形物消耗量Fig.2 Consumption of soluble solid contents with amino acid addition

2.2.2有机酸、甘油及酒精度的变化

添加不同氨基酸发酵10d后，荔枝酒的理化指标见表1。如表1所示，L-Arg与L-Gln处理样的苹果酸质量浓度随着添加氨基酸含量的增加而减少，而D-Ala处理样的苹果酸含量无特别明显的变化。与对照样相比，随着添加氨基酸浓度的增加，D-Ala与L-Gln处理样的琥珀酸质量浓度先减少后增加，而L-Arg则呈现小幅度的降低趋势。各处理样的丙酮酸含量均有所增加，且与氨基酸质量浓度成正比，氨基酸种类不同而添加量相同的处理样差异不显著（P＞0.05）。D-Ala与L-Arg的添加对柠檬酸的含量无明显影响，但L-Gln处理样中的柠檬酸的含量增加，且与氨基酸浓度呈成正比趋势。发酵结束后，各处理样的pH值均有极小幅度的增加，且与氨基酸添加量成正比。

与空白样相比，各处理样的酒精度均显著增加（P≤0.05），所有处理样的酒精度均在氨基酸添加量为60 mg/L时达到最大值，L-Gln处理样的酒精度升高程度最为显著。直至发酵完全，氨基酸处理样的甘油含量明显低于空白样。酿酒酵母在厌氧条件下生长，通过减少过剩的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）形成和增加生物合成中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的消耗可以减少甘油的形成并且增加酒精的产量［11］。甘油的主要作用是在高糖浓度或者其他压力源存在的条件下调控渗透压，在发酵的前两天，在转化酶存在的条件下，蔗糖进行水解，增加了葡萄糖和果糖的含量，这可能增加了渗透压进而增加了甘油产量［12］。然而，氨基酸可以作为渗透压保护剂进而抑制了甘油生成的需要［13］。

表1　荔枝酒的理化指标Table 1 Phsicochemical parameters of lychee wine

2.3氨基酸添加对挥发性组分的影响

如表2所示，荔枝酒中共检测出27种挥发性物质，大致分为七大类。其中醇类、酸类以及羧基化合物在挥发性化合物中占较大比例，尤其是醇类化合物占整个挥发性化合物的比例达到74%以上。

表2　荔枝酒中挥发性成分的相对含量Table 2 Relative constituents of volatile components in lychee wine　%

2.3.1醇类

高级醇是酵母酒精发酵阶段自身代谢形成的，其主要生成途径为氨基酸降解代谢和糖类物质合成，虽然含量过高的高级醇会对人体造成危害，但酒中高级醇含量过少则会导致酒体风味单薄［14-15］。添加氨基酸后高级醇的含量增加，这与氨基酸过剩在转氨酶的作用下，脱氨产生α-酮酸，α-酮酸在脱羧酶的作用下生成醛，而后醛在脱氢酶的作用下，进一步还原为醇类有关。在中高质量浓度的L-Arg与L-Gln处理样中，正丙醇的含量有着较为明显的增加，而在D-Ala处理样中，其没有明显变化。与空白样相比，处理样中的异丁醇与1，2-丙二醇含量分别有不同程度的增加和减少，而2-甲基丁醇的含量并未出现明显变化。作为荔枝酒含量最高的高级醇，2，3-丁二醇在L-Gln处理中变化范围最为显著，且其含量有着先降低后增加而后又有小幅度的降低趋势。与此同时，D-Ala处理样的3-甲基丁醇、苯甲醇以及4-羟基苯乙醇的含量明显高于空白样和其他处理样，且其含量与氨基酸质量浓度成正比，与D-Ala处理样相比，其他两种氨基酸的添加对这三种物质的影响并不够明显。这说明，添加氨基酸后醇类变化较为明显，且不同氨基酸对醇类的影响作用不同。

2.3.2酯类

在荔枝酒发酵的酵母代谢过程中，酯类物质主要由乙酰辅酶A化合物的酵解和氨基酸的碳骨架生成，它们赋予荔枝酒特殊的果香味和花香味［16］。如表2所示，D-Ala处理样的乙酸丙酯含量明显高于其他样品，且随着丙氨酸质量浓度的增加而增加，而其它氨基酸处理样的乙酸丙酯含量没有表现出明显变化。乙酸丙酯有着极为柔和的果香味，能够赋予荔枝酒独有的香气。

2.3.3挥发酸

乙酸的含量影响着荔枝酒发酵过程中的酵母细胞生长、产物合成及代谢等，乙酸体积分数过高会给荔枝酒带来明显的苦味和酸味［16］。荔枝酒中乙酸的来源主要来自醋酸菌的氧化、酵母的代谢以及异型乳酸发酵。如表1所示，D-Ala处理样的乙酸含量明显降低，且随着D-Ala添加量的增加而减少，L-Arg处理样各水平间的乙酸含量没有明显变化。这说明，D-Ala的添加可以在一定程度上抑制挥发酸含量的升高，不同种类的氨基酸对荔枝酒中乙酸的产生影响不同，浓度范围也要依据氨基酸的种类来定。氨基酸的添加使得荔枝酒中的辛酸由无到有。虽然辛酸具有令人不愉快的气味，但它可以与醇类生成酯类，是优化果酒品质的重要保障［17］。氨基酸的添加并未对异山梨酸的含量产生明显影响。

2.3.4硫化物

在极低浓度下，硫化物仍能产生使人不愉快的气味，并且极难清除，极大地影响了荔枝酒的品质［18］。如表2所示，添加氨基酸后，二甲基硫少量出现。D-Ala处理样的3-甲硫基丙醇含量增加，其他两种氨基酸处理样的3-甲硫基丙醇含量在不同的氨基酸浓度下，没有明显变化或者未被检出。

2.3.5羰基化合物

乙醛是果酒发酵过程中产生的副产物，会给果酒带来不成熟的口感甚至是辛辣感。因此，降低乙醛的含量对提升荔枝酒的品质具有重要意义。如表2所示，与空白样相比，处理样的乙醛含量均有不同程度的降低，且随着氨基酸质量浓度的增大，含量呈现先减少后增多的趋势。添加氨基酸后，各处理样的4，5-二甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮均有不同程度降低。

3　结论

在荔枝酒中添加不同质量浓度以及种类的氨基酸，明显改变了荔枝酒的发酵动力及发酵过程中产生的非挥发性成分和挥发性成分，且不同种类与浓度的氨基酸对荔枝酒的的影响不同。特定浓度与种类氨基酸的添加不仅加快了酿酒酵母的发酵速率也增加了荔枝酒中的优良组分，减少了不良组分。关于氨基酸添加对发酵荔枝酒的影响机制，还需更加长远的探索。毕竟不同酿酒酵母能够产生不同风味和香气的醇类以及挥发性中间代谢物，不同的氨基酸对荔枝酒发酵的影响也不同，而且发酵所需的氨基酸浓度还与发酵温度、pH值等密切相关。

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Effect of amino acids supplementation on fermentation dynamics and quality of lychee wine

SHANG Yuhui1，ZHU Ping2，ZHONG Qiuping1*
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228，China）

Supplementation of D-alanine，L-arginine，L-glutamine with different concentration in the range of 160-480 mg/L was added into lychee juice，respectively.The effects of supplementation on the fermentation dynamics，non-volatile and volatile constituents produced during the fermentation of lychee wine were investigated.The results showed that addition of different types and concentrations of amino acids increased the consumption rate of soluble solid contents at different degrees，while shortened the yeast fermentation time，increased total alcohols，and significantly changed acids and esters content.The ethanol content was slightly increased from 10.52%vol in the blank sample to 10.71%vol-11.68%vol in the treatment sample，whereas the glycerol content decreased from 6.33 g/L to 4.17-6.04 g/L，and the acetaldehyde content was also decreased obviously.Different type and amino acid concentration supplement had the different impact on lychee wine.

lychee wine；fermentation；amino acid；volatile constituents

TS261.4

0254-5071（2016）07-0166-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.036

2016-01-27

国家自然科学基金资助项目（No.31260398）

商玉荟（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品发酵。

钟秋平（1966-），男，教授，博士，研究方向为食品发酵。