梨白兰地中乙醇碳同位素分布特征研究

程 涛，钟其顶 *，王道兵，武竹英，李国辉，王 敏

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100015；3.全国食品发酵工业标准化中心，北京 100015）

白兰地生产在我国历史悠久，然而直至中国第一个民族葡萄酒企业—张裕葡萄酿酒公司成立后，国内白兰地才真正得以发展。改革开放以后，我国的白兰地工业和国外交流频繁，较好的实现了与国际接轨，特别是近几年来，随着人们生活水平的提高，白兰地逐渐被人们所喜爱[1-2]。目前，国产白兰地的年产量为2 000万L左右，大量白兰地产品需从国外进口，其中仅干邑白兰地的销售总量就超过了2 700万L（2012年数据），天然白兰地的工艺复杂，酿造成本较高，因而价格也较高，也正因为此，国内白兰地市场比较混乱。据调查，市场的假洋白兰地的比例不断上升，另有一些不法商家为节约成本，掺入廉价的糖与果汁进行发酵，或者直接采用食用酒精进行勾兑以冒充天然白兰地。

根据GB/T 17204—2008《饮料酒分类》的定义，白兰地是以新鲜水果或果汁为原料，经发酵、蒸馏、陈酿、调配而成的蒸馏酒。但诸如掺入廉价糖或果汁进行发酵，或以食用酒精等食品添加剂进行生产的假冒伪劣产品，其理化指标可能与正规的白兰地产品相近或相同，因此当前广泛使用的理化分析法难以对其进行区分和辨别[3-5]。

稳定同位素技术在食品掺假鉴别中具有重要作用，现在已成功用于果汁掺水[6-7]、掺糖分析[8-9]、蜂蜜掺糖[10-11]、谷物和水果酒精的质量评价[12-14]及植物学来源[15-19]等多个方面。ROBMANN A等[20]分别应用该技术甄别葡萄酒、龙舌兰酒和白兰地[21]真假，钟其顶等[22]研究了稳定碳同位素技术在固态法白酒和固液法白酒鉴别中的应用，效果良好。然而，国内还未有白兰地领域的相关应用，尤其缺乏稳定同位素分布特征及影响因素的研究。本研究以梨白兰地为研究对象，调查了其乙醇碳同位素分布特征，分析了其主要的影响因素，探讨了应用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪（gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry，GC-C-IRMS）辨别白兰地产品真假的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

梨汁样品：选取新鲜、饱满、无病斑、无划痕的果实，去除果梗、果核和果皮，切成瓣状放入搅拌机中搅拌5 min，2 000 r/min 离心10 min取上清液，冷藏待用；梨果：2013年4月至2014年9月购自北京某农贸市场和家乐福超市；梨原白兰地：北京某梨白兰地厂；安琪活性干酵母；去离子水；氢氧化钙粉末；0.1 mol/L硫酸溶液；氦气（纯度≥99.999%）；丙酮（色谱纯）：韩国DUKSAN Pure Chemicals有限公司。除特殊注明外，所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Delta V advantage 气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪（配Triplus自动进样器）、安捷伦DB-Wax毛细管色谱柱（50 m×0.32 mm×0.20 μm）；FLASH 2000元素分析-同位素比值质谱仪（element analysis-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）：美国Thermo fisher公司；3K15离心机：美国Sigma公司；LGJ-JA-80冷冻干燥机：北京亚泰科隆仪器技术有限公司；ZH7924电热恒温水浴箱：北京中慧天城科技有限公司；HDM-1000磁力搅拌器：北京世纪华科实验仪器有限公司；XS205U十万分之一天平：瑞士Mettler-Toedo公司；LRH系列恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；1500夏朗德壶式蒸馏器：新乡市圣达轻工机械有限公司；JE25C11榨汁机：美的集团。

1.3 方法

1.3.1 糖的分离提取

取40 mL果汁于50 mL离心管中，在相对离心力（relative centrifugal force，RCF）1 400×g条件下离心10 min，然后将上清液转移至100 mL小烧杯中，加入1.6 g氢氧化钙粉末，搅拌均匀后于90 ℃水浴中静置3 min；将上述热溶液转移至50 mL离心管中，在RCF为1 400×g条件下离心3 min，弃去沉淀，取上清液，用0.1 mol/L的硫酸调整其pH 值为5.0左右；将上述酸化后的上清液置于4 ℃冰箱静置约15 h，去除沉淀，将溶液冷冻干燥并均质成粉末。

1.3.2 发酵处理

取果汁100 g，高压蒸汽灭菌后加入1.0 g安琪酿酒活性干酵母，无氧条件下在25 ℃恒温培养箱中发酵至质量恒定。

1.3.3 乙醇的处理

乙醇经过丙酮稀释后由自动进样器进样，进入燃烧管充分燃烧成CO2，再由载气带入IRMS中测定其δ13C值。

1.3.4 测定条件

GC-C-IRMS色谱程序：载气为氦气；柱流速1.0 mL/min；进样口温度200 ℃；升温程序为：起始温度40 ℃，保持5 min，以1 ℃/min 升温至50 ℃后保持1 min后以15 ℃/min 升温至200 ℃并保持2 min；进样体积1 μL；分流比20∶1。

EA-IRMS工作条件：氧化管温度980 ℃，还原管温度680 ℃，柱温60 ℃，氦气流速100 mL/min[25]。

1.3.5 糖的测定

称取约0.1 mg粉末于锡杯中，包好后待测，每个样品平行测定2次，得出样品的δ13C值。

1.3.6 乙醇的测定

发酵液经丙酮稀释后直接进样测定，每个样品测定两次。

1.3.7 结果表示

实际工作中采用相对测量法，将待测样品的碳同位素比值与碳同位素国际标准美国南卡罗来纳州白垩纪皮狄组层位中的拟箭石化石（peedee belemnite，PDB）同位素比值比较，以千分差（‰）的形式表示样品的同位素组成，记作δ13C。δ13C的计算公式如下：

Rsample和Rstandard分别表示样品和国际标准品的同位素（13C/12C）比率。

2 结果与分析

2.1 乙醇δ13C值分布特征

选取北京、新疆、河北等地区的梨，榨汁后发酵，GCC-IRMS测定乙醇δ13C值，结果见表1所示。

表1 不同地区水果发酵后乙醇δ13C值Table 1 Ethanol δ13C of fruit in different regions after fermentation

表1数据表明，梨汁发酵乙醇的δ13C值分布范围为-29‰～-27‰，符合C3植物发酵产生的乙醇的碳同位素特征；但是，尽管同是梨汁发酵，同一产地不同品种的梨汁发酵乙醇δ13C值很接近，而不同产地的梨汁乙醇δ13C值差异却比较大。为研究该现象产生的原因，测定了各梨汁的总糖中δ13C，以梨汁总糖的δ13C值（x）为横坐标，发酵后乙醇的δ13C值（y）为纵坐标，绘制其相关性曲线，结果见图1。

图1 酵前总糖和乙醇的δ13C值之间的相关性Fig.1 Correlation of δ13C values between sugar content and ethanol before fermentation

由图1可知，尽管总糖与乙醇的δ13C值之间存在一定差异（-29.01‰～-25.31‰），但二者相关性良好（R2=0.98），这与ROBMANN A等从葡萄汁与葡萄汁发酵液中得到的结果一致；虽然决定植物有机物δ13C值分布特征的是植物的光合作用类型[27]，但同种植物，由于各自生长环境中的温度、湿度、光照条件、大气压力、盐分和营养元素含量的差异，均会影响植物稳定同位素的分馏过程乃至植物稳定同位素组成，而发酵过程中糖的同位素组成差异则显现在其代谢产物乙醇中。

2.2 白兰地蒸馏过程的影响

自然界存在着广泛的稳定同位素分馏作用，若转化/收集不完全，由于不同稳定同位素构成的分子的质量差异，稳定同位素含量易出现变化。白兰地是一种高雅香醇的饮料酒，它的芳香物质主要是通过蒸馏获得的，为研究该工序对乙醇δ13C值的影响，在蒸酒过程进行跟踪取样，测定馏分中乙醇的含量和δ13C值，结果见图2。

图2 精馏过程中乙醇含量和δ13C变化Fig.2 Change of δ13C values and ethanol content during rectification

由图2可知，蒸酒过程中，随着馏分中乙醇含量不断降低，乙醇δ13C值也呈现不断变小的趋势，第一次与最后一次取样的乙醇δ13C值差异达1.5‰，但对于可陈酿部分（50%vol～80%vol），乙醇的δ13C值平均为-28.48‰，与发酵醪中乙醇的（δ13C=-28.51‰）十分接近，因此可以断定，尽管白兰地生产时需用水对陈酿酒进行稀释（至40%vol左右），但由于无外源乙醇的混入，天然白兰地的乙醇δ13C值不再变化。

2.3 添加玉米酒精对白兰地中乙醇δ13C的影响

以玉米酒精和蒸馏水为基础配制与梨白兰地浓度相同的乙醇水溶液，分别按比例5%、15%、30%、50%向梨白兰地中加入上述乙醇水溶液，混合均匀后测定乙醇δ13C值，结果见图3。

图3 外源酒精添加比率与白兰地中乙醇δ13C值(‰)的关系Fig.3 Linear relation between exogenous ethanol addition and δ13C values of brandy alcohol

由图3可知，添加玉米酒精后，乙醇δ13C值出现明显变化，且随着玉米酒精比例的增加而逐渐偏正（R2=0.99）。表1结果表明，梨汁发酵乙醇δ13C值的自然波动范围为-29‰～-27‰，当混入15%玉米酒精时样品乙醇δ13C值则已超出95%的置信区间。

2.4 发酵前加入蔗糖对乙醇δ13C的影响

选择北京地区的梨汁为研究对象，根据其糖浓度向梨汁中加入10%、30%、50%、70%、80%、90%甘蔗糖溶液，发酵后测定发酵液的乙醇δ13C值，结果见图4。

图4 外源蔗糖添加比率与白兰地中乙醇δ13C的关系Fig.4 Linear relation between exogenous sucrose addition and δ13C values of brandy alcohol

由图4可知，发酵液乙醇δ13C与甘蔗糖含量呈良好的线性正相关关系（R2=0.98），这是由于梨为C3植物，而甘蔗为C4植物，二者的糖中δ13C值明显不同，因此，可利用乙醇δ13C值检测来判断发酵原料的真实属性。因此乙醇δ13C值可作为白兰地产品中酒精来源或发酵原料溯源的有效指示剂。

3 结论

本实验研究了梨汁的糖和发酵液乙醇中δ13C值特征，梨汁的糖和乙醇明显表现出C3植物的碳同位素分布特征，并且乙醇与糖的δ13C值具有良好的线性关系。而作为白兰地生产特殊组成部分的蒸酒工艺，虽然出现了乙醇碳同位素分馏，但陈酿部分与发酵醪相比具有相同的乙醇δ13C值特征，因此乙醇δ13C值可作为白兰地产品中酒精来源或发酵原料溯源的有效指示剂。模拟实验表明，利用乙醇δ13C值可检测出15%的玉米酒精，也能帮助判断白兰地的发酵原料中是否混入C4植物成分。本研究为酒类食品真实性的鉴别提供一个新的手段，适合推广应用，同时也为进一步规范我国饮料酒生产提供技术支撑。需要说明的是，本研究仅调查分析了部分地区的梨的特征，由于植物糖分中碳同位素分布受众多因素影响，选择乙醇δ13C值作为客观指标检测各白兰地产品中的玉米酒精或检测生产原料中的C4植物糖（浆），还需详尽的数据作为应用的基础。

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