中国和美国赤霞珠干红葡萄酒产地鉴别模型构建的应用研究

梁娜娜，刘 萤，王琳丽，王珮玥，吕美玲，王金花，张朝晖，韩 深*

（1.北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 100026；2.安捷伦科技中国有限公司，北京 100102）

随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，葡萄酒受到了人们的热捧。我国作为葡萄酒新兴产业国家，其生产量和消费量呈现快速增长的趋势，成为同类饮料行业中成长速度最快的子行业，而日益严重的葡萄酒真酒假标等不良现象已成为妨碍我国葡萄酒产业健康发展的关键问题。因此为了提高葡萄酒的质量，保障消费者买到货真价实的葡萄酒，需要建立完善的葡萄酒质量保护和监督体系，对葡萄酒进行原产地的保护，为葡萄酒真伪鉴别提供技术支撑。葡萄酒是在一定的气候、土壤等生态条件下并通过相应的工艺进行酿造的结果。葡萄中重要的风味物质在酿酒过程中由果皮浸渍转移到酒中，决定着葡萄酒的口感、香味及色泽，而原产地气候环境、地质情况、土壤条件等环境因素极大地影响着葡萄酒的风味物质，进而影响葡萄酒的质量和风格，因此可通过分析这些风味物质来对不同产地葡萄酒进行鉴别[1-2]。近年来利用风味物质进行葡萄酒真伪鉴别系统的研究在国外迅速兴起[3-6]，建立的鉴别系统大多数只适用于某地区或某些品种葡萄酒，与地区或企业对自身产品的保护、质量监督有关[7-8]。SERRANO-LOURIDO D等[3]对西班牙佩内德斯（Penedes）、杜埃罗河岸（Ribera del Duero）和里奥哈（Rioja）三个重要的葡萄酒主产区的90款葡萄酒进行了产地分析与鉴别，并根据酚类物质进行了偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）的模型构建，判别准确率高达90%以上，而且利用质谱对模型鉴别的特征物质进行了鉴定，提出了每个产区的特征化合物。BELLOMARINO S A等[4]利用主成分分析和线性判别技术对来自澳大利亚吉朗（Geelong）和库纳瓦拉（Coonawarra）两个主产区的赤霞珠葡萄酒成功进行了产区的鉴别分析，准确率高达91%[4]。SERAPINAS P等[5]采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）对来自智利、保加利亚、法国、匈牙利、意大利、西班牙、美国共7个国家的103 款葡萄酒进行了矿质元素的检测分析，应用主成分分析发现，部分矿质元素可有效对不同国家的葡萄酒进行区分，准确率可达90%。KALLITHRAKA S等[6]基于风味物质结合感官分析结果，采用主成分分析技术成功鉴别了希腊北部和南部两个原产地。

目前大部分研究人员集中探究葡萄酒成分的检测分析，忽略了葡萄酒的颜色评价。颜色特征是葡萄酒的重要指标之一，常采用国际葡萄与葡萄酒组织（International Vine and Wine Organization，OIV）推荐的CIELab法进行葡萄酒颜色的检测分析，引入葡萄酒的亮度（L*）、红/绿颜色参数（a*）和黄/蓝颜色参数（b*），通过视觉感知特定品质属性色调（Tonality）、亮度（Luminosity）和色差（Chmmatism）来客观评价葡萄酒的颜色[9]。本文采用高分辨率质谱进行葡萄酒代谢物轮廓分析，应用化学计量学工具和高级数据挖掘系统进行数据的筛选，分析了中国三个葡萄酒主产区和美国两个酒庄的赤霞珠干红葡萄酒，结合葡萄酒颜色评价有效进行了葡萄酒产区的鉴别，这将为葡萄酒的产地溯源提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

来自中国三个主产区的赤霞珠（V.viniferaL.cv.Cabernet Sauvignon）干红葡萄酒样品共70支，分别是来自山东产区（CN-SD）20支酒、河北怀来产区（CN-HBHL）24支酒、河北昌黎产区（CN-HBCL）26支酒，这些酒样由中粮葡萄酒有限公司、中国农业大学食品科学与营养工程学院提供。来自美国纳帕峡谷（Napa valley，US）的两个知名酒庄的赤霞珠干红葡萄酒，分别是Robert Mondavi酒庄（US-RM）20支酒和V.Sattui酒庄（US-V.S）23支酒，这些酒样由北京出入境检验检疫局提供。以上样品对于原产地的信息有足够的代表性和真实性，置于酒柜冷藏待用。

甲醇、乙腈、乙酸铵均为色谱纯：美国Fisher公司；甲酸（色谱纯）：美国Tedia公司；实验用水是经Milli-Q净化系统过滤的超纯水（电阻率≤18.2 MΩ）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290系列超高压液相色谱-Agilent 6530高分辨飞行时间质谱联用仪（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectra，UPLC-QTOFMS）：美国安捷伦科技公司；Sartorius 1-14离心机：美国Sigma公司；Milli-Q净化系统：美国Millipore公司；0.45 μm微孔滤膜：英国Whatman公司；UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CIELab法测定葡萄酒颜色

用蒸馏水作为参比，采用0.2 cm光程，取过滤后的葡萄酒样品用分光光度计分别于波长440 nm、530 nm、600 nm处测定透光率并计算L*、a*和b*值[10]，样品重复分析3次。

1.3.2 液相色谱质谱

葡萄酒样品12 000 r/min离心10 min后经0.45 μm滤膜过滤，直接进入Agilent 1290 UPLC-QTOF-MS仪器检测。

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相（A）：水溶液（含5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸）；流动相（B）：V（甲醇）∶V（水）=95∶5（含5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40 ℃。梯度洗脱程序：0～1 min，1%B；1～8 min，1%B～15%B；8～15 min，15%B～45%B；15～17 min，45%B～90%B；17～20 min，90%B。

离子源：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式：正离子（positive）全扫描模式；干燥气温度和流量：325 ℃和11 L/min；鞘气温度和流量：350 ℃和12 L/min；毛细管电压：3 500 V；喷嘴电压：500 V；扫描方式：MS Scan（质荷比范围100～1 100）和Targeted MS/MS（质荷比范围50～1 100）；雾化器压力：45 psig；碰撞电压：130 V；采集速率：MS Scan（2 spec/sec）和Targeted MS/MS（3 spec/sec）；使用调谐液参比离子进行分子量实时较准，正模式参比离子：121.050 9和922.009 8。

1.3.3 数据处理与分析

数据采集：Agilent MassHunter Software Ver.B.05.00；数据处理：Mass Profiler Professional Ver.12.5；作图软件：SigmaPlot 10.0。

2 结果与分析

2.1 赤霞珠葡萄酒主成分分析

所有葡萄酒样品采用全扫模式进行检测分析，经分子特征提取（find by molecular feature）化合物后导入MPP软件进行数据过滤。为了得到更有代表性的化合物，分别经频率过滤、同组内数据变异系数、方差分析（P=0.01）和组间含量倍数差异（fold change，FC=3），得到每个组的特征物。主成分分析（principle component analysis，PCA）是一种能够有效对数据进行降维的多元统计分析方法，以最少的信息丢失将原有变量浓缩并重新组合成互相无关的少数几个综合变量因子，可通过2-D和3-D的形式呈现更直观的聚类结果[11-14]。中国三个主产区和美国两个酒庄的赤霞珠干红葡萄酒进行PCA分析得到4个主成分因子（principal component，PC），累积贡献率52.93%，PC1、PC2、PC3和PC4的贡献率分别为33.43%、8.02%、6.51%和4.97%。图1呈现的是分别以两个主成分子和三个主成分因子得到的2-D和3-D图，可看出中国和美国的赤霞珠酒样之间存在着明显差异，中国三个产区的葡萄酒样品点全部位于PC1的正半轴，美国两个酒庄的样品点全部位于PC1的负半轴，可根据样品的PC1得分区别开。但中国的山东、河北昌黎、河北怀来三个葡萄酒主产区没有分开，美国两个酒庄也没有分开，从葡萄酒风味物质的角度分析，葡萄酒在同一个国家不同产区之间的差异远远小于不同国家之间的差异，因此把两个国家的五个产区共同进行主成分分析，国家差异得到较好地呈现，而同一个国家不同产区之间由于差异相对较小从而混杂在一起未得到较好的区分，这也是导致中国和美国赤霞珠葡萄酒累计贡献率较低的原因。

图1 中国三个产区和美国两个酒庄赤霞珠干红葡萄酒主成分分析2-D(A1)及3-D(A2)图Fig.1 2-D (A1) and 3-D (A2) graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines of three regions in China and two wineries in USA

因此为了对同一个国家不同产区进行区分，分别对中国三个葡萄酒产区、美国两个酒庄的葡萄酒样品进行了主成分分析，得到了较好的鉴别结果见图2。图2B1和图2B2分别是中国三个葡萄酒产区主成分分析的2-D和3-D图，得到的4个主成分因子贡献率分别是44.04%、17.42%、8.47%和5.34%，累积贡献率达75.27%。图2B1可看出，河北昌黎产区样品在PC1轴呈现较大负值，明显与其他产区区分，山东产区酒样较好地聚类在第四象限，河北怀来产区独立聚类在第一象限，但样品点分布相对较散，在图2B2也可看出。河北怀来产区分布相对较散的样品点可能与当地“V”型盆地造成的明显微气候差异有关。

图2 中国三个产区赤霞珠干红葡萄酒主成分分析2-D(B1)及3-D(B2)图Fig.2 2-D (B1) and 3-D (B2) graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines of three regions in China

图3 美国两个酒庄赤霞珠干红葡萄酒主成分分析2-D(C1)及3-D(C2)图Fig.3 2-D (C1) and 3-D (C2) graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines of two wineries in USA

图3C1和图3C2分别是美国纳帕峡谷两个葡萄酒庄的酒样主成分分析的2-D和3-D图，得到的4个主成分因子贡献率分别是62.32%、7.39%、4.45%和3.56%，累积贡献率达77.72%，可看出单独对纳帕峡谷两个酒庄的样品进行主成分分析，有明显区别。根据实验结果发现，对葡萄酒产区的鉴别需要逐层递进地分析，先忽略小产区间的差异进行国家之间的鉴别，在此基础上再进行该国内多个葡萄酒小产地的差异分析。

2.2 赤霞珠葡萄酒产区鉴别模型的构建

赤霞珠葡萄酒的PCA分析得到了较好的产区聚类结果，因此为了便于有效地进行聚类程度的评价和盲样的鉴别，采用化学计量学软件依据风味物质的分析结果进行产区鉴别模型的构建，常用的构建方式：偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、反向传播人工神经网络（back-propagation artificial neural network，BP-ANN）和朴素贝叶斯算法模型（Naive Bayes Model，NBM）构建。PLS-DA是一种基于特征变量用偏最小二乘法回归作为核心算法的计算方法，在大量数据中根据组间的差异特征进行样品分类[11-13]。BP-ANN是神经网络模式识别系统中最广泛使用的一种算法，包含输入层、输出层和隐含层三层网络，是输入信号正向传播与误差反向传播的各层权值周而复始进行不断调整的模型训练过程[13-15]。NBM也是较为广泛使用的分类模型，根据样品的特征属性进行划分形成训练样本集合，通过每个样品在各个类别的训练样本中的出现频率及其特征属性，估计每个样品的概率。表1呈现的是中国三个产区和美国两个酒庄赤霞珠干红葡萄酒鉴别模型构建的三种算法计算结果，准确率由预测结果正确的样品个数与总样品个数比值得到，每个模型都是经交叉验证逐步完善的。PLS-DA模型使用N-fold方式的交叉验证程序，分成3份，重复运算10次。

由表1可看出，PLS-DA模型准确率达95.9%，河北昌黎产区和河北怀来产区仅各有2个样品错误预测，而中国山东产区和美国两个酒庄的准确率高达100%，但置信度（confidence）较低，仅约0.50，说明该模型对酒样产地的判断结果可信度较低。BP-ANN模型使用Leave one out的交叉验证程序，运算速率0.7，迭代次数100，该模型准确度较低为66.3%，虽然河北昌黎产区和美国两个酒庄的酒样判别准确率达到了100%，但山东产区的准确率仅6.7%，15个酒样中仅1个样品判断正确，而河北怀来产区的19个酒样全部错误地判断为河北昌黎产区。这两个产地过低的准确率导致整个模型准确率下降，说明该模型不适用于这些产地的溯源。NBM模型使用Leave one out的交叉验证程序，准确率92.9%，河北怀来产区和美国两个酒庄的准确率达100%，山东产区和河北昌黎产区样品的准确率约80%，而且置信度较高接近1.0，说明该模型可以准确地进行中国和美国赤霞珠葡萄酒的产地溯源。根据三种运算方式构建模型的准确率和置信度进行比较，选择了朴素贝叶斯算法构建的中国和美国赤霞珠干红葡萄酒真伪鉴别的NBM模型。

表1 中国三个产区和美国两个酒庄赤霞珠干红葡萄酒鉴别模型构建的三种运算方法结果Table 1 Model training and cross-validation results of Cabernet Sauvignon dry red wines from three regions in China and two wineries in USA by three operation method

表2 中国三个产区赤霞珠干红葡萄酒鉴别模型构建的三种运算方法结果Table 2 Model training and cross-validation results of Cabernet Sauvignon dry red wines from three regions in China by three operation method

由于进行了中国三个葡萄酒主产区的酒样主成分分析和判别，因此同样采用这三种运算方法其进行了产地鉴别模型的构建，结果见表2。PLS-DA模型使用N-fold方式的交叉验证程序，分成5份，重复运算20次，三个产区的葡萄酒样品判别准确率均达到100%，置信度0.60～0.90。BP-ANN模型使用Leave one out的交叉验证程序，运算速率0.7，迭代次数100，该模型准确率98.0%，置信度0.95～0.99，山东和河北怀来产区的准确率达到100%，仅河北昌黎产区的准确率为95.2%。与PLS-DA和BP-ANN模型相比较，NBM模型错误地把三款山东产区的葡萄酒样品聚类到河北怀来产区，准确率相对较低，但也达91.8%，置信度约1.0。因此对中国三个产区的赤霞珠葡萄酒进行产地鉴别时，主要采用BP-ANN模型。

2.3 不同产区葡萄酒CIELab颜色参数

图3 不同产区葡萄酒CIELab颜色参数范围Fig.3 Color values range for CIELab parameters in wines from different regions

利用PCA分析和化学计量学软件对赤霞珠葡萄酒产地鉴别模型的成功构建，可看出不同产地的赤霞珠葡萄酒风味物质有着明显差异，因此采用CIELab法进行葡萄酒色度色调的检测分析，试图在葡萄酒的外观表现上分析产区的差异（见图3）。L*代表葡萄酒的颜色深浅，a*、b*分别与红绿颜色、黄蓝颜色强度相关，图3呈现的是不同产区葡萄酒CIELab颜色参数的范围，可看出美国两个酒庄赤霞珠干红葡萄酒的三个颜色参数值范围比较接近，且相对较高，说明这两个酒庄生产的葡萄酒样质量比较恒定，且葡萄酒颜色强度较深。中国的三个葡萄酒产区亮度较高，a*和b*颜色参数值范围相对较低，说明与美国产区相比，中国葡萄酒的颜色强度相对较低。而且河北怀来产区的葡萄酒参数范围较大，与PCA分析图中怀来产区样品点相对较散一致，可能受“V”型盆地的微气候影响造成。

2.4 模型预测

选取15支中国产区的赤霞珠干红葡萄酒，山东产区、河北怀来产区和河北昌黎产区各5支，采用中国三个产区的赤霞珠葡萄酒BP-ANN产地鉴别模型进行预测，结果见表3。由表3可知，除山东产区和河北昌黎产区各有1支酒被错误地预测为河北怀来产区，其余13支酒均准确地进行了预测，准确度达86.7%，且置信度较高，说明构建的BP-ANN鉴别模型可适用于中国这三个产区的赤霞珠葡萄酒产地溯源。

表3 中国三个产区赤霞珠干红葡萄酒BP-ANN鉴别模型的预测结果Table 3 Model prediction results of Cabernet Sauvignon dry red wines from three regions in China by BP-ANN

3 结论

近年来葡萄酒的产地溯源已经成为妨碍葡萄酒市场发展的关键问题，本研究应用UPLC-QTOF-MS对葡萄酒风味物质进行了代谢轮廓分析，采用化学计量学工具成功进行了中国三个产区和美国两个酒庄赤霞珠葡萄酒产地溯源的PCA分析和模型构建，同时根据CIELab法进行葡萄酒颜色参数分析，从外观表现上也可看出葡萄酒产区间的差异。根据准确度和置信度比较了偏最小二乘法判别分析、反向传播人工神经网络和朴素贝叶斯算法三种方法构建模型的优劣，并应用构建的模型有效进行了葡萄酒盲样的产地鉴别，准确率达86.7%。但目前建立的模型样本量较少，在未来研究中随着样本量的扩充将会逐步完善产地鉴别模型，为产地溯源工作奠定基础。

[1]贾文庆，尤 扬，刘会超.ICP-AES 测定红提葡萄叶片中矿物质元素含量[J].光谱实验室，2010（5）：1837-1839.

[2]高年发，李 丽，张 健.采用模式识别方法鉴别中国干红葡萄酒的产区和品种[J].中国酿造，2009，28（3）：68-72.

[3]SERRANO-LOURIDO D,SAURINA J,HERNÁNDEZ-CASSOU S,et al.Classification and characterization of Spanish red wines according to their appellation of origin based on chromatographic profiles and chemometric data analysis[J].Food Chem,2012,135(3):1425-1431.

[4]BELLOMARINO S A,CONLAN X A,PARKER R M,et al.Geographical classification of some Australian wines by discriminant analysis using HPLC with UV and chemiluminescence detection[J].Talanta,2009,80(2):833-838.

[5]SERAPINAS P,VENSKUTONIS P R,ANINKEVI IUS V,et al.Step by step approach to multi-element data analysis in testing the provenance of wines[J].Food Chem,2008,107(4):1652-1660.

[6]KALLITHRAKA S,ARVANITOYANNIS I S,KEFALAS P,et al.Instrumental and sensory analysis of Greek wines；implementation of principal component analysis(PCA)for classification according to geographical origin[J].Food Chem,2001,73(4):501-514.

[7]ALMEIDA C M,VASCONCELOS M T.ICP-MS determination of strontium isotope ratio in wine in order to be used as a fingerprint of its regional origin[J].J Anal Atom Spectrom,2001,16(6):607-611.

[8]COETZEE P P,VANHAECKE F.Classifying wine according to geographical origin via quadrupole-based ICP-mass spectrometry measurements of boron isotope ratios[J].Anal Bioanal Chem,2005,383(6):977-984.

[9]PÉREZ-MAGARIÑO S,GONZÁLEZ-SANJOSÉ M L.Application of absorbance values used in wineries for estimating CIELab parameters in red wines[J].Food Chem,2003,81(2):301-306.

[10]AYALA F,ECHÁVARRI J F,NEGUERUELA A I.A new simplified method for measuring the color of wines III.all wines and brandies[J].Am J Enol Viticult,1999,50(3):359-363.

[11]KRUZLICOVA D,FIKET Ž,KNIEWALD G.Classification of Croatian wine varieties using multivariate analysis of data obtained by high resolution ICP-MS analysis[J].Food Res Int,2013,54(1):621-626.

[12]SÂRBU C,NA CU-BRICIU R D,KOT-WASIK A,et al.Classification and fingerprinting of kiwi and pomelo fruits by multivariate analysis of chromatographic and spectroscopic data[J].Food Chem,2012,130(4):994-1002.

[13]BROWN S D,TAULER R,WALCZAK B.Comprehensive chemometrics,chemical and biochemical data analysis[M].Amsterdam:Elsevier,2009.

[14]CHEN H,FAN C L,CHANG Q Y,et al.Chemometric determination of the botanical origin for Chinese honeys on the basis of mineral elements determined by ICP-MS[J].J Agr Food Chem,2014,62(11):2443-2448.

[15]KRUZLICOVA D,MOCAK J,BALLA B,et al.Classification of Slovak white wines using artificial neural networks and discriminant techniques and discriminant techniques[J].Food Chem,2009,112(4):1046-1052.