赤霞珠葡萄酒中矿质元素的品种特点及其在产地鉴别中的应用

韩 深，梁娜娜，孔维恒，古 瑾，高 峰，王珮玥，刘 萤*

（北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 100026）

HAN Shen,LIANG Nana,KONG Weiheng,GU Jin,GAO Feng,WANG Peiyue,LIU Ying*

(Inspection and Quarantine Testing Center,Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026,China)

矿质元素是葡萄酒的重要组成，对葡萄酒的颜色和风味都有重要影响[1-2]。由于葡萄酒是用新鲜葡萄果实或葡萄汁经完全或部分酒精发酵酿制而成的含酒精饮料，因此其矿质元素主要来源于葡萄原料中，而决定葡萄中矿质元素种类和含量的主要因素取决于葡萄种植和生长的环境（包括土壤、水质、气候等）。全世界葡萄主要种植带分布于北纬30～52°和南纬15～42°，由于不同地域的土壤结构、水质资源以及光照、气候条件各不相同，由此酿制而成的葡萄酒也就拥有了各自的产地特点。SERAPINAS P等[3]采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）对保加利亚、智利、法国、匈牙利、意大利、西班牙和美国共7个国家的103支酒进行了23种矿质元素的检测分析，得到了较好的聚类分析结果，并提取了几种特征矿质元素用于产地鉴别，准确率达90%。THIEL G等[4]对德国多个产区的葡萄酒样品进行了矿质元素和稀土元素的检测分析，并采用主成分分析等化学计量学方法成功进行了酒样原产地鉴别。GREENOUGH J D等[5]检测了加拿大多个葡萄酒产地酒样的20种矿质元素，采用化学计量学方法对数据进行过滤和分析，发现利用这些矿质元素可进行产地的溯源，准确率达90%。FABANI M P等[6]进行了阿根廷三个葡萄酒产地的11种矿质元素的检测分析，利用葡萄酒中K、Fe、Ca、Cr、Mg、Zn和Mn共7个元素含量采用逐步判别分析（stepwise discriminant analysis，SDA）可100%准确鉴别葡萄酒产地。ZOU J F等[7]对中国7个葡萄酒产地酒样的矿质元素进行了检测，并应用逐步线性判别分析（Stepwise linear discriminant analysis，SLDA）进行数据过滤与分析，发现利用Sc、V、Cr、Ga、Se、Sr、Pd、Sn、Tl 和U等元素即可有效进行葡萄酒产地鉴别。多国研究人员的研究结果表明，利用矿质元素可以有效进行葡萄酒的产地鉴别[8-12]。因此检测分析葡萄酒中的多种矿质元素及不同产地葡萄酒矿质元素含量及种类的差异性，有助于认识和了解葡萄酒的产地特征，为产地鉴别提供有效的技术支撑[13-14]。

重金属污染随着全球工业化的加剧日益严重，为了确保人们可以安全放心地饮用葡萄酒，对一些重金属元素污染应格外关注。国际葡萄与葡萄酒组织（International Vine and Wine Organization，OIV）和我国国标中仅对葡萄酒中的部分元素进行了限量标准的规定[15]，如铅（Pb）＜200μg/L，锌（Zn）＜4 000 μg/L，铜（Cu）＜1 000 μg/L等，但其他一些未进行限量标准规定的元素对人体健康也很重要。因此建立葡萄酒中多种矿质元素的准确灵敏的检测方法十分必要，有助于对葡萄酒质量的监测。目前研究中常用于测定葡萄酒矿质元素的检测方法包括原子吸收光谱法（atomic absorptionspectrometry，AAS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等。AAS虽能够测定部分元素，但进行多元素分析时一次进样只能测定单一元素，检测效率较低；ICP-AES可以实现一次进样进行多种元素的同步分析，但面对基质干扰时难以准确定性；ICP-MS以其灵敏度高、线性范围宽、谱线简单及可同时进行多元素分析等优点，迅速成为应用广泛的矿质元素分析技术，有效地将ICP的高温电离特性与四极杆质谱仪灵敏快速的优点完美结合，解决了大多数样品的多元素分析。

因此本研究采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测分析葡萄酒中的多种矿质元素，采用微波消解法进行葡萄酒样品前处理，最大程度减少前处理过程中的损失，具有较好的安全性。本研究选取了法国、智利和摩尔多瓦三个产地的41支赤霞珠干红葡萄酒进行分析，比较分析了三个产地葡萄酒中31种矿质元素的含量与分布，采用主成分分析和化学计量学方法进行了产地鉴别模型构建，为产地鉴别提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠（V.viniferaL.cv.Cabernet Sauvignon）干红葡萄酒样品共41支，分别来自法国产区（11支）、智利产区（22支）及摩尔多瓦产区（8支），这些酒样由北京出入境检验检疫局提供。以上样品对于原产地的信息有足够的代表性和真实性，置于酒柜冷藏待用。

31种矿质元素标准溶液，包括钠（Na）、镁（Mg）、钾（K）、钙（Ca）、钛（Ti）、钒（V）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、锶（Sr）、钡（Ba）、砷（As）、钪（Sc）、钇（Y）、镧（La）、铈（Ce）、镨（Pr）、钕（Nd）、钐（Sm）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）、镝（Dy）、钬（Ho）、铒（Er）、铥（Tm）、镱（Yb）、镥（Lu）；2种内标溶液，包括铑（Rh）和铼（Re），纯度均≥99.0%：国家标准物质研究中心；硝酸（BV-III级）和双氧水（优级纯）：国药化学试剂公司；超纯水（电阻率为18.2 MΩ）经Milli-Q净化系统过滤。

用5%稀硝酸配制31种矿质元素和2种内标元素的标准储备液，于4 ℃条件下保存待用；配制标准工作曲线时，根据要求将储备液稀释成不同浓度，于4 ℃条件下保存，工作曲线现用现配。

1.2 仪器与设备

电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）：美国Agilent公司；微波消解仪（MARs Xpress）：美国CEM公司；远红外耐酸碱恒温热板（MEA-3）：国产；超纯水仪（Milli-Q），美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄酒样品的微波消解

准确量取2.0 mL葡萄酒于微波管中，在耐酸碱恒温热板上以120 ℃挥发乙醇1 h，冷却后于微波管中依次加入5.0 mL硝酸和3.0 mL双氧水，置于微波消解仪中进行消解，微波消解控制程序见表1。消解结束后将微波管置于耐酸碱恒温热板上150 ℃排酸1 h，转移至10 mL具塞比色管中，以超纯水定容至刻度，于4 ℃条件下保存待仪器分析。

表1 微波消解控制程序Table 1 Control program by microwave digestion equipment

1.3.2 ICP-MS仪器条件

功率：1 550 W；载气流速：0.77 L/min；雾化气流速：1.0 L/min；雾化器类型：Micromist；取样深度：8 mm；雾化室温度：2 ℃；ORS3碰撞池载气流速（He）：5 mL/min；每个样品重复测定3次。

1.3.3 标准曲线的建立

配制的各元素标准系列溶液按照ICP-MS仪器条件分析，计算各元素的回归方程和相关系数，见表2，可看出相关系数均满足实验要求。

1.4 数据处理与分析

数据分析与处理：SPSS 11.5 software 和Mass Profiler Professional Ver.12.5（Agilent Technologies，USA）；作图软件：SigmaPlot 10.0。

2 结果与分析

2.1 赤霞珠葡萄酒中矿质元素的品种特点

表2 31种元素标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围Table 2 Regression equation,correlation coefficient and linear range of 31 elements

采用ICP-MS对法国、智利、摩尔多瓦三个产地的赤霞珠干红葡萄酒进行了31种矿质元素的检测，分别是Na、Mg、K、Ca、Fe、Mn、Zn、Sr、Ti、V、Cr、Ni、Cu、As、Ba、Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。由图1可看出，虽然不同国家产地的葡萄酒中矿质元素含量存在差异，但在分布上呈现一定的特点。Na、Mg、K和Ca含量最高，均高于10 mg/L，尤其K的含量最高可达300 mg/L，远高于其他三种元素，且K＞Ca＞Mg＞Na，邹俊峰等[16]对中国五个产区的葡萄叶片进行矿质元素的检测发现K、Ca和Mg属于含量最高的一组矿质元素，由于葡萄酒的矿质元素主要来源于葡萄果实，而葡萄叶片是果实吸收土壤中矿质元素的重要器官，因此葡萄叶片与葡萄果实的矿质元素有较高的一致性。Fe、Mn、Zn和Sr含量次之，为0.5～8 mg/L，Fe＞Mn＞Sr≈Zn，其中Fe的含量远高于其他三种元素。Ti、Cr、Cu和Ba的含量为0.1～0.35 mg/L，且Cr的含量明显高于其他三种元素。V、Ni和As的含量为0.01～0.1mg/L，其中As的含量明显低于V和Ni。稀土元素包括Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu共16种元素，在三个产地的赤霞珠葡萄酒中总含量均＜0.01 mg/L，其中Ce、La、Y、Sc含量较高，占总稀土元素的60%以上。

2.2 三个产地赤霞珠葡萄酒矿质元素指纹谱图的建立

赤霞珠葡萄酒来源于三个产区，包括法国的朗格多克-鲁西荣产区（Languedoc-Roussillon）、智利的中央山谷（Central valley）和摩尔多瓦的艾图拉产区（Etulia）。朗格多克-鲁西荣产区位于法国最南部地中海沿岸一带，典型的地中海气候，大西洋强烈的干冷风与地中海岸潮湿温暖的季风交替，葡萄生长季气候干旱炎热，日照充足，全年平均气温在摄氏14 ℃，土质主要是石灰质和砂砾层。智利中央山谷葡萄产区包括美波谷（Maipo Valley）、空加瓜谷（Colchagua Valley）、马利谷（Maule Valley）、库里科谷（Curico Valley）等八个小山谷，该产区有着肥沃的砂质土壤和温暖的地中海气候。摩尔多瓦的艾图拉产区境内山丘绵延起伏，属温带大陆性气候，气候温和，阳光充足，年降水量为400～500 mm，土壤呈石灰岩和粘土特质，75%以上的土地为黑钙土。

图1 赤霞珠葡萄酒中矿质元素的品种特点Fig.1 Varietal characterization of mineral elements in Cabernet Sauvignon wines

为了便于比较产区间矿质元素的含量分布特点，把三个产地同种元素的含量分布置于一个图中，而且把检测到的31种元素分为两组：非稀土元素和稀土元素。图2呈现的是三个产地赤霞珠葡萄酒中较高含量矿质元素的分布。可以看出，K是葡萄酒中最丰富的元素，在三个产区的葡萄酒中没有明显差异。摩尔多瓦葡萄酒中Na含量约60 mg/L，是法国和智利葡萄酒中Na含量的2倍，而法国和智利葡萄酒中Na含量没有明显差异。Mg、Mn和Ba在智利和摩尔多瓦葡萄酒中含量较高，明显高于法国葡萄酒。Ca、Zn、Cu、Ti、V和As在三个产区的葡萄酒中没有明显差异。摩尔多瓦葡萄酒中Sr和Ni含量最高，智利酒中Sr的含量高于法国，而Ni刚好相反。智利酒中的Fe含量最低，摩尔多瓦酒中的Cr含量较高。

图3呈现的是三个产地赤霞珠葡萄酒中16种稀土元素含量和总含量的分布，可以看出，16种稀土元素Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu在摩尔多瓦产区的含量均远高于其他两个产区，而法国和智利葡萄酒产区的稀土元素含量没有明显差异。每种稀土元素在每个产地的含量分布相对比较集中，明显与其他产地区分。摩尔多瓦产区的稀土元素总含量达到0.005 mg/L以上，而法国和智利产区的总稀土元素含量仅达其一半。葡萄酒中的稀土元素主要来源于葡萄果实，而葡萄园是葡萄果实稀土元素的主要来源。不同产区葡萄果实对稀土元素的吸收受葡萄品种、产区气候条件、葡萄园施肥等多个因子调节，但葡萄园土壤结构、类型和性质是影响其含量高低的主要因素，从而导致了葡萄酒中稀土元素的含量差异。含有较高含量稀土元素的摩尔多瓦葡萄酒产区75%以上为黑钙土，是在特定气候条件下草原植被经历腐殖质积累的土壤，有较厚的黑色腐殖质层，土质肥沃，积累大量的有机质，且通气性、透水性、保肥性均较好，因此相比其他产区，摩尔多瓦葡萄园产区肥沃的黑钙土提供给葡萄果实相对较高含量的稀土元素，进而生产的葡萄酒含有高含量的稀土元素。

图2 三个产地赤霞珠葡萄酒矿质元素指纹谱图Fig.2 Fingerprint graphs of mineral elements distribution in Cabernet Sauvignon wines from three wine production regions

图3 三个产地赤霞珠葡萄酒中稀土元素指纹谱图Fig.3 Fingerprint graphs of rare earth elements distribution in Cabernet Sauvignon wines from three wine production regions

2.3 主成分分析（PCA）

法国、智利和摩尔多瓦葡萄酒中31种矿质元素的含量分析可看出，不同产区葡萄酒的矿质元素有着明显的产区特异性。因此通过MPP软件采用化学计量学方法对31种矿质元素原始数据进行频率过滤（filter by frequency）、方差分析（analysis of variance）、含量倍数差异（fold change）等一系列数据过滤，共得到14种代表法国、智利和摩尔多瓦葡萄酒三组间差异的特征矿质元素，分别是Na、Mg、Cr、Mn、Fe、Ni、As、Sr、Ba、Eu、Er、Tm、Yb和Lu。对这三个产地的14种特征矿质元素进行了主成分分析，得到四个主成分因子贡献率分别是53.23%、17.45%、8.03%和6.79%，累积贡献率达85.50%，说明通过数据降维可有效地代表葡萄酒样本量的信息。用前两个和三个主成分因子做散点图得到的图4可看出，2-D图中智利葡萄酒样品点集中地分散在PC2的正半轴，法国葡萄酒样品点集中在PC2和PC1的负半轴，摩尔多瓦样品点聚集在PC2的负半轴和PC1的正半轴，在3-D图也可直观地看出三个产区的葡萄酒可以有效进行区分。因此Na、Mg、Cr、Mn、Fe、Ni、As、Sr、Ba、Eu、Er、Tm、Yb和Lu共14种特征元素可用来鉴别法国、智利和摩尔多瓦赤霞珠葡萄酒。

图4 三个产地赤霞珠干红葡萄酒主成分分析的2-D和3-D图Fig.4 2-D and 3-D graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines from three wine production regions

2.4 模型构建

表3 法国、智利和摩尔多瓦赤霞珠干红葡萄酒的模型构建Table 3 Model training and cross-validation results of Cabernet Sauvignon dry red wines from France，Chile and Moldova by PLS-DA

采用化学计量学软件利用偏最小二乘法判别分析算法（partial least squares discriminant Analysis，简称PLS-DA）构建了法国、智利和摩尔多瓦赤霞珠葡萄酒鉴别的模型。PLS-DA模型使用N-fold方式，分成5组（Number of Folds），重复运算20次，由表3可看出，模型准确率达97.6%，智利和摩尔多瓦产区的赤霞珠葡萄酒判别率均为100%，仅法国产区的1个样品误判为来自摩尔多瓦，导致模型准确度降低。而且所有酒样的判别置信度（confidence）均高于0.8，说明构建的该PLS-DA模型对法国、智利和摩尔多瓦赤霞珠酒样的产地鉴别结果可靠，可信度较高。

表4 特征矿质元素在鉴别模型中对法国、智利和摩尔多瓦产区的影响Table 4 Effect of characteristic mineral elements in identification model on Cabernet Sauvignon dry red wines from France,Chile and Moldova

表4 是Na、Mg、Cr、Mn、Fe、Ni、As、Sr、Ba、Eu、Er、Tm、Yb和Lu这14种特征矿质元素在构建的PLS-DA模型中对三个产地的影响，根据三个产地同种元素的数值可以看出，三个产地葡萄酒中该特征矿质元素的差异，由表4可以看出，所筛选的14种元素可以成功对法国、智利和摩尔多瓦三个产地赤霞珠葡萄酒进行鉴别，因此在此基础上构建的PLS-DA模型是可以应用的。

3 结论

本研究结果显示，虽然法国、智利、摩尔多瓦三个产地的赤霞珠葡萄酒中矿质元素含量存在差异，但在分布上呈现一定的赤霞珠品种特点，Na、Mg、K和Ca含量最高，均＞10 mg/L，稀土元素总含量均＜0.01 mg/L，其中Ce、La、Y、Sc含量较高，占总稀土元素的60%以上。摩尔多瓦产区葡萄酒中16种稀土元素的含量和总含量均远高于其他两个产地，可能缘于该产区肥沃的黑钙土提供给葡萄果实较高含量的稀土元素。此外根据Na、Mg、Cr、Mn、Fe、Ni、As、Sr、Ba、Eu、Er、Tm、Yb和Lu14种特征矿质元素进行了主成分分析和产地鉴别模型构建，准确率达97.6%，因此根据这些矿质元素可以有效进行法国、智利和摩尔多瓦赤霞珠葡萄酒的产地鉴别。

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