以发芽大豆为原料固态发酵产富含纳豆激酶食品工艺优化

时间：2024-07-28

黄勋，王常苏，高泽鑫，高冰*

（1.武汉生物工程学院生物科学与技术系，湖北武汉 430415；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉 430023；3.湖北工业大学轻工学部，湖北武汉 430068）

血栓是由纤维蛋白原和血小板聚集形成的[1]，常引发脑梗塞、心肌梗塞和中风等疾病，是一种严重危害人类健康的心血管疾病[2]。纳豆激酶属于纳豆枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，体内体外实验都已证明具有高效的溶栓活性[3-4]，其不仅可以直接溶解交联状的血栓，而且可以催化血纤维蛋白原转化成有活性的血纤维蛋白原溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成，增强体内血栓的溶解活性[5]。目前，纳豆激酶主要被用作功能食品使用，作为潜在药品的应用正在研发中。与临床常用的溶栓药物相比，纳豆激酶作为功能食品食用具有安全性好、生产成本低、无毒副作用、半衰期长、易口服等诸多优点。因此，纳豆激酶相关产品是纤溶酶产业化开发中最为热门的产品。

以大豆为原料发酵制备的纳豆激酶产品，因存在着不愉快的气味和口感，限制其在国内的推广。大豆因营养价值丰富而被誉为“来自田野的肉制品”。以大豆为主要原料的豆制品近年来备受广大消费者的青睐，其中豆芽是人们喜欢的食物之一[6]。大豆经过适当的发芽后，降低了大豆中的抗营养因子（如植酸、胀气因子、脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂），提高了大豆的营养价值，并能形成独特的风味和口感，近年来，用豆芽加工的产品的相继问世[7]。大豆在发芽过程中脂肪、总糖含量降低，满足了人们对于低脂肪、低糖、高蛋白大豆的需求[8-11]，尤其是大豆发芽过程中一些功能性因子的生物合成和积累引起了人们关注，如大豆经适当的发芽，提高了大豆中异黄酮的含量[12-13]以及γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，γ-GABA）的积累量。大豆异黄酮具有抗氧化，预防骨质疏松，预防心血管疾病以及抗癌等丰富的功能[14-20]。GABA是一种非蛋白氨基酸，广泛分布于动物和植物体内，并具有多种人体的生理功能，是哺乳动物的神经系统的主要抑制性递质。目前市售的GABA保健品药物，多数是经化学合成得到，对身体是有一定的副作用且价格昂贵。GABA具有多功能的生理保健作用，对于其应用到深度产品的研发中是十分有价值的[21-26]。

因此选用发芽大豆为原料制备富含纳豆激酶的食品，不仅改善了产品的口感，而且丰富了产品的功能性，为纳豆激酶相关食品的开发提供了理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus natto）BN-05：由本实验室保存。

1.1.2 培养基

LB培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L琼脂，pH 7.0。液体种子培养基：10 g/L葡糖糖，5 g/L酵母提取物，10 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.4～7.6。

1.1.3 主要试剂

纤维蛋白原标准试剂（88 mg可凝蛋白/支）、牛凝血酶（560 U/支）、尿激酶生物标准品（1 240 IU/瓶）：中国药品生物制品检定所；琼脂糖：法国Biowest公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D超净工作台：广州瑞智科学仪器有限公司；WFJ2100紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；LHS-250SC 型智能型恒温恒湿培养箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SLY-2112B立式双层大容量恒温培养摇床：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；5424R冷冻离心机：德国Eppendorf公司；SPS2001F感量2 000 g天平：奥豪斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发芽大豆的制备

首先进行人工精选，再用蒸馏水冲洗，加入蒸馏水在室温条件下浸种，放大镜观察大豆的种子生长状况，并依据GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》对发芽大豆中γ-氨基丁酸的含量进行检测分析[27]。

1.3.2 固态发酵工艺

将精选的发芽大豆进行清洗除杂，加入5倍质量的清水，20～25 ℃浸泡6～8 h，沥去水分，115 ℃灭菌30 min，待其冷却至35 ℃以下，接种发酵培养，于37 ℃静置恒温培养，每隔12 h搅拌一次。发酵结束后，提取粗酶液，用琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶（nattokinase，NK）酶活。

1.3.3 固态发酵工艺试验设计

（1）Plackett-Burman法筛选影响发酵的主要因素

通过单因素试验确定了影响固态发酵产纳豆激酶的参数为发芽大豆的蒸煮时间、基质含水量、装样量、发酵温度、葡萄糖添加量、发酵时间、接种量以及Mg2+的添加量。选用试验次数N=12的Plackett-Burman设计安排，对这八个因素进行研究，分别记作A、B、D、E、G、H、K、L，每个参数分别取2个水平，另外设置3个虚拟项C、F、J，用于对试验误差进行估计，各因素水平取值见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

（2）响应面试验设计

在对Plackett-Burman试验结果充分分析的基础上，在最陡坡试验确定的区域内，采用中心组合设计（central composite design，CCD)响应面设计方法，以纳豆激酶酶活为响应值对显著因素进行优化，各因素水平和编码见表2。

表2 CCD试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of CCD test

1.3.4 功能成分分析及产品营养分析

功能成分分析：纳豆激酶活性的测定采用琼脂糖-纤维蛋白原法进行测定[28]。γ-GABA含量的测定依据国标GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》。

产品营养成分分析：发酵发芽大豆的营养成分检测委托武汉市产品质量监督检验所和湖北省农业科学院质量标准与检验技术研究所共同完成，检测方法参考SB/T 10528—2009《纳豆》、GB/T 5009.124—2003、GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》。

2 结果与分析

2.1 发芽大豆的制备工艺

（1）精选大豆，去除无胚粒、未成熟颗粒及杂质，用自来水冲洗三遍，洗去表面的灰尘；

（2）用0.05%NaClO溶液浸泡20～30 min，再用纯净水冲洗3～5 min去除表面的NaClO，沥干水分；

（3）加入纯净水在20～25 ℃条件下浸泡6～8 h；

（4）浸泡完成后，沥干水分，将大豆均匀地摊在底部有小孔的经过消毒的培养篮中中，盖上已消毒的纱布，在纱布上面喷洒适量的纯净水，移入23 ℃的恒温培养箱中，每隔2 h喷洒适量的纯净水以保持大豆的湿度，每隔8 h用纯净水冲洗大豆以免被霉菌污染，整个发芽过程，湿度控制在80%～95%，发芽时间为26～30 h，芽长1～2 mm。

（5）依据国家标准GB/T 5009.124—2003对发芽大豆进行检测分析，γ-氨基丁酸的含量达到233.56 mg/100 g干基。

2.2 Plackett-Burman 试验结果及分析

Plackett-Burman具体试验设计及结果见表3。

表3 发酵条件优化Plackett-Burman试验结果Table 3 Results of Plackett-Burman experiment for fermentation conditions optimization

表4 发酵条件优化Plackett-Burman 试验因素方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiment for fermentation conditions optimization

由表4可知，发酵温度（E）、接种量（K）、Mg2+（L）对固态发酵产酶有显著的影响，因此最终筛选的主效应参数为E、K、L，接种量的增加、Mg2+及发酵温度的降低，纳豆激酶的活力呈先升后降的趋势，且在不同的处理时间都存在着显著性差（P＜0.05），因此后续试验选择E、K、L这三个因素进行中心点的设计。

2.3 响应面中心组合设计结果及分析

2.3.1 中心组合设计结果及回归模型分析

根据Plackett-Burman试验确定的主效应参数，通过Design-expert 8.0软件设计响应面中心组合试验，CCD的试验设计结果见表5，回归方程方差分析见表6。

表5 发酵条件优化CCD试验结果Table 5 Design and results of CCD experiment for fermentation conditions optimization

最小乘法拟合二次多项式，试验因子和响应面的关系可用以下方程表示：

由表6可知，模型本身（P＜0.000 1）非常显著，且模型失拟项0.229 4＞1.902 296，差异不显著，故模型选择合适，有实际应用意义。回归模型的R2=94.04%，表明相关性显著，失拟项不显著，表明多项式对试验拟合情况较好，试验误差小。决定系数R2adj=0.886 909，说明该模型能解释94.05%响应值的变化决定系数反映了方程对数据拟合的程度，因此响应值的94.05%可以通过该二次回归方程来解释，说明拟合的模型较合适。

表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

根据上述的回归方程及回归模型方差分析表，绘制各因素交互作用响应面和等高线图，结果见图1。

图1 发酵温度、接种量、Mg2+含量对纳豆激酶酶活交互影响的响应面和等高线Fig.1 Response surface plots and contour line showing the effect of interactions of fermentation temperature,inoculum,Mg 2+concentration on NK activity

由图1可看出，当发酵温度、接种量与Mg2+添加量三个变量中的某一个因素固定于中心水平时，其他两个因素共同作用对试验结果的影响呈抛物面型关系，变化趋势都是先增大后减小，且响应面均存在一个极大值点。接种量与Mg2+添加量的交互效应对纳豆激酶活力影响较显著，其结果和表6描述的一致。

此回归模型得出CCD试验的最优培养条件为培养温度35.16 ℃，接种量7.17%，Mg2+的添加量0.20%，纳豆激酶的活力6 987.67 IU/g。

2.3.2 验证试验

为方便实际操作，将回归模型中得到的最佳工艺参数定为培养温度为35 ℃，接种量为7%，Mg2+的添加量为0.20%，按此条件进行3次平行试验，发酵完成后，测定纳豆激酶的活力为6 918.76 IU/g，结果表明纳豆激酶的活力与预测值相差不大，说明该方程与实际值拟合情况很好，结果见表7。

表7 响应面分析的验证试验Table 7 Verification test of the response surface analysis

在优化单因素和响应面条件，选择大豆及发芽大豆进行对照，由表8可知，发芽大豆为发酵底物优于大豆。

表8 发酵底物对照试验Table 8 Control test of fermentation substrate

3 结论

相比大豆而言，发芽大豆不仅降低了抗营养因子，富集了丰富的γ-氨基丁酸（γ-GABA），而且发芽大豆的营养成分满足了人们对于低糖、低脂肪、高蛋白大豆的需要，所以选用发芽大豆作作为原料更符合现代食品发展的理念，以此作为发酵底物优化产纳豆激酶的发酵条件。

通过单因素预试验确定影响产NK酶活的因素，采用Plackett-Burman法筛选出影响发酵的主要因素为发酵温度、接种量和Mg2+的添加量，再通过中心组合设计方法，建立了产酶回归模型，确定了该模型最佳取值时各参数水平：蒸煮时间15 min、基质含水量55%、装样量30 g/250 mL、发酵温度35 ℃、接种量7%、发酵时间36 h、Mg2+添加量0.20%，其中接种量与Mg2+添加量的交互效应对产酶活力影响最显著。再次通过验证性试验，证明了在响应面优化条件下，纳豆激酶的活力为6 918.76 IU/g，比以大豆为原料提高了58.35%。

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